ANEXO I

ESPECIFICAÇÕES TÉCNICAS REFERIDAS NO ARTIGO 4.O

PARTE A

Base de amostragem

A monitorização deve ser realizada em lotes para abate no matadouro, a fim de evitar efeitos relacionados com a idade.

Uma vez que se demonstrou que a prevalência de Campylobacter spp. varia significativamente com as estações do ano, deve proceder-se a uma estratificação. Para o efeito, deve dividir-se um período de 12 meses em 12 períodos de um mês. Em cada um desses períodos, deve colher-se 1/12 da dimensão total da amostra.

A amostragem deve basear-se ainda numa selecção aleatória, tanto em termos de matadouros e dias de amostragem em cada mês como em termos dos lotes que devem ser amostrados num dia de amostragem seleccionado. O programa de aleatorização deve, nomeadamente, garantir uma selecção de lotes para abate proporcional ao número de bandos engordados de acordo com diferentes tipos de produção (convencional, ao ar livre, biológica). Além disso, o estatuto de Salmonella spp. ou de Campylobacter spp., se conhecido no momento do abate, não deve falsear a aleatorização. A autoridade competente deve assumir a responsabilidade de elaborar um programa de aleatorização e garantir a sua correcta execução. Pode encontrar-se um exemplo de procedimento de aleatorização no relatório relativo às especificações técnicas propostas para um programa de monitorização coordenado para Salmonella e Campylobacter em carne de frango na União Europeia, elaborado pela task force da EFSA sobre recolha de dados relativos a zoonoses. Os pormenores do programa de aleatorização devem ser comunicados à Comissão.

PARTE B

Dimensão da amostra

1.   Dimensão da amostra primária

a)	A dimensão da amostra primária indica o número de lotes para abate a testar;

b)	Devem ser amostrados pelo menos 384 lotes para abate. A amostragem deve ser aproximadamente superior em 10 % ao número indicado, para prever a possibilidade de não-resposta;

c)	Em derrogação à alínea b), na Estónia, na Letónia e no Luxemburgo, o número de lotes para abate amostrado deve ser o seguinte (1): i) na Estónia, pelo menos 96 lotes para abate, ii) na Letónia, pelo menos 120 lotes para abate, iii) no Luxemburgo, pelo menos 12 lotes para abate.

2.   Dimensão da amostra secundária

A dimensão da amostra secundária indica o número de frangos a amostrar por cada lote para abate. Esse número deve ser de 10 aves para a detecção de Campylobacter em cecos e de uma ave para a detecção de Campylobacter e de Salmonella em carcaças. As amostras de cecos e a amostra de carcaça devem provir do mesmo lote para abate.

PARTE C

Colheita, manuseamento e análise de espécimes para a detecção e os testes à resistência antimicrobiana de Campylobacter spp. em bandos de frangos

1.   Colheita e transporte

As espécies do género Campylobacter são organismos relativamente frágeis que morrem rapidamente fora do intestino do hospedeiro. Assim, devem tomar-se as devidas precauções para que as amostras sejam colhidas de forma adequada e analisadas rapidamente. Devem evitar-se temperaturas excessivas e o transporte deve ser o mais rápido possível.

As amostras a colher são cecos intactos. As amostras cecais devem ser colhidas aquando da evisceração.

As amostras serão colhidas apenas por pessoal com formação em procedimentos normalizados de amostragem. O principal objectivo consiste em minimizar a contaminação externa do conteúdo cecal durante a amostragem. A melhor maneira de o conseguir é através de uma cuidadosa tracção manual na junção com o intestino. Deve colher-se um ceco intacto por ave, e os amostradores devem comprovar que o ceco está cheio ou, caso contrário, rejeitá-lo. As aves devem ser amostradas, de preferência, aleatoriamente em todo o lote (evitando a primeira parte do lote), colhendo amostras de aves não consecutivas. Os 10 cecos colhidos podem ser colocados num único saco/embalagem estéril para transporte.

A autoridade competente deve registar num formulário de amostragem todas as informações importantes que se possam obter da amostra, a fim de poder respeitar os requisitos da parte E respeitantes aos relatórios. Cada amostra e respectivo formulário devem ser rotulados com um número único, que deve ser utilizado desde a fase da amostragem até à fase dos testes. A autoridade competente deve providenciar a implementação e a utilização de um sistema de numeração única. Para a amostra de carcaça, deve utilizar-se o mesmo identificador do lote para abate.

As amostras cecais constituídas por cecos intactos devem ser transportadas para o laboratório no prazo de 24 horas (ou seja, por correio expresso ou serviço postal privado) e ser aí imediatamente analisadas. Caso não seja possível, as amostras devem ser mantidas refrigeradas, pelo menos até serem transportadas para o laboratório, devendo ser analisadas num prazo não superior a 72-80 horas após a amostragem. No laboratório, as amostras que não puderem ser testadas no dia de chegada devem ser mantidas refrigeradas até serem analisadas.

No laboratório, o conteúdo cecal deve ser assepticamente retirado e reunido numa amostra composta.

2.   Método de diagnóstico

2.1.   Cultura

A cultura directa de um meio selectivo proporciona uma boa estimativa da prevalência de Campylobacter. A cultura directa da amostra deve ser realizada num meio selectivo adequado a Campylobacter, (ou seja, meio selectivo modificado isento de sangue para Campylobacter (CCDA), Karmali ou Preston Agar).

As placas devem ser incubadas a 41,5 ± 1 °C, em atmosfera de microaerofilia, durante pelo menos 48 +/– 2 horas. O crescimento pode ser detectado após 24 horas.

Pode obter-se a atmosfera de microaerofilia em incubadoras de microaerofilia à venda no mercado (mistura gasosa 10 % CO2/6 % O2). Caso essas incubadoras não estejam disponíveis, podem utilizar-se sistemas de cultura de microaerofilia, por exemplo, jarras de gás. Há no mercado sistemas de envelope de gás (gas pack) que proporcionam uma atmosfera de microaerofilia adequada.

Para cada lote de amostras colocadas em cultura devem ser incluídos controlos positivos e negativos adequados.

2.2.   Confirmação e especiação do género Campylobacter

O isolamento e a confirmação dos organismos Campylobacter deve realizar-se de acordo com a norma ISO 10272-1:2006(E). Deve ser especiado pelo menos um isolado de Campylobacter por lote, utilizando-se métodos fenotípicos descritos na norma ISO 10272-1:2006(E) ou métodos moleculares publicados, como por exemplo as técnicas de reacção de polimerização em cadeia (PCR). Deve indicar-se o método utilizado. O isolado especiado deve ser utilizado para posteriores testes antimicrobianos.

Caso o laboratório tenha pouca experiência em especiação, deve armazenar o isolado do modo indicado em 2.4 enquanto aguarda formação suplementar ou enviá-lo para um laboratório mais experiente após consulta do laboratório comunitário de referência para Campylobacter.

2.3.   Controlo de qualidade

Para efeitos de garantia da qualidade, deve ser enviada ao laboratório comunitário de referência para Campylobacter uma percentagem de isolados de Campylobacter spp. constituída por, no máximo, oito isolados para que se proceda à confirmação e à especiação.

Essa percentagem de isolados deve ser enviada ao laboratório, quer num só lote quer trimestralmente. Se os isolados tiverem de ser transportados entre laboratórios, devem utilizar-se condições adequadas (por exemplo, meio de transporte com carvão).

2.4.   Armazenamento

Deve ser armazenado no LNR pelo menos um isolado por amostra positiva, recorrendo ao método normal para a colecção de culturas do LNR, desde que garanta a viabilidade das estirpes durante, pelo menos, dois anos.

2.5.   Testes à resistência antimicrobiana

O número de isolados de Campylobacter a incluir na vigilância da resistência antimicrobiana por Estado-Membro deve ser de 170. Não se deve incluir na vigilância mais de um isolado por espécie de Campylobacter proveniente do mesmo lote para abate.

Nos Estados-Membros em que, num determinado ano, esteja disponível um número de isolados inferior à dimensão prevista da amostra, todos esses isolados deverão ser incluídos na vigilância da resistência antimicrobiana.

Nos Estados-Membros em que está disponível um número de isolados superior, usam-se todos os isolados ou uma selecção aleatória representativa de dimensão igual ou superior à prevista para a amostra.

Os Estados-Membros devem testar pelo menos os agentes antimicrobianos que estão especificados no quadro 1, usando os valores-limite apresentados, e uma gama de concentrações adequada para determinar a susceptibilidade de Campylobacter.

Quadro 1

	Agente antimicrobiano	Valor-limite (mg/L) R >
Campylobacter jejuni	Eritromicina	4
	Ciprofloxacina	1
	Tetraciclina	2
	Estreptomicina	2
	Gentamicina	1
Campylobacter coli	Eritromicina	16
	Ciprofloxacina	1
	Tetraciclina	2
	Estreptomicina	4
	Gentamicina	2

Os métodos de diluição devem ser realizados de acordo com os métodos descritos nas Directrizes M31-A3, 3a edição, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals e nas Directrizes M100-S16, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing do CLSI; Sixteenth International Supplement.

PARTE D

Colheita, manuseamento e análise de espécimes para a detecção de Campylobacter spp. e de Salmonella spp. em carcaças de frangos

1.   Colheita e transporte

Deve recolher-se uma carcaça inteira por lote para abate imediatamente após a refrigeração, mas antes de qualquer outro tratamento subsequente, tal como a congelação, o corte ou a embalagem. Em alguns matadouros, isto pode significar que as amostras são colhidas após a pré-refrigeração, quando se tratar do último passo antes dos tratamentos seguintes.

A amostra colhida deve ser colocada num saco de plástico estéril individual para evitar a contaminação cruzada e deve ser enviada ao laboratório onde se procederá à amostragem da pele.

Deve evitar-se que haja contaminação cruzada por outras carcaças ou amostras de cecos durante a recolha das carcaças. Por conseguinte, devem ser tomadas precauções em todas as fases para assegurar que o equipamento utilizado durante a amostragem, o transporte e o armazenamento não esteja contaminado pelos agentes patogénicos investigados no estudo.

A autoridade competente deve registar num formulário de amostragem todas as informações importantes que se possam obter da amostra, a fim de poder respeitar os requisitos de informação da parte E.

Cada amostra e respectivo formulário devem ser rotulados com um número único, que deve ser utilizado desde a fase da amostragem até à fase dos testes. A autoridade competente deve providenciar a implementação e a utilização de um sistema de numeração única. Para as amostras dos cecos, deve utilizar-se o mesmo identificador do lote para abate.

As amostras devem ser mantidas a temperaturas compreendidas entre + 2 e + 8 °C e devem estar isentas de contaminação externa durante o transporte.

Idealmente, todas as amostras devem chegar ao laboratório nas 24 horas seguintes à sua colheita. Em situações excepcionais (por exemplo, viagens longas, fins-de-semana e feriados) esse período pode ser alargado até 80 horas.

Caso sejam utilizados laboratórios diferentes para os testes a Campylobacter e a Salmonella, o laboratório que realiza os testes a Campylobacter deve ter prioridade na recepção da amostra.

2.   Amostragem no laboratório e métodos analíticos

2.1.   Recepção das amostras

Ao receberem as amostras, os laboratórios devem verificar as informações registadas pelo amostrador e preencher as secções pertinentes do formulário de amostragem.

As amostras serão mantidas a + 2-8 °C no laboratório, e o processo laboratorial deve começar o mais rapidamente possível após a chegada das amostras ao laboratório e num prazo não superior a 72-80 horas após a colheita.

2.2.   Preparação das amostras

Todas as amostras recebidas devem ser examinadas para assegurar que a embalagem de transporte está intacta antes da realização dos testes.

O manuseamento de ser feito de forma a evitar, em todas as fases, a contaminação cruzada entre amostras e a partir do ambiente circundante.

Com luvas descartáveis, o técnico deve retirar o frango do saco, tendo o cuidado de não contaminar a superfície exterior do frango.

Utilizando um instrumento esterilizado e em condições de assepsia, a pele do pescoço deve ser removida, caso esteja presente, bem como a pele de um dos lados da carcaça evitando a gordura, juntando uma porção para teste de 27 g, colocando-a em seguida num saco de Stomacher (ou Pulsifier).

2.3.   Suspensão inicial

A porção para teste de 27 g deve ser transferida para 9 volumes (243 ml) de água peptonada tamponada (BPW), à temperatura ambiente. A mistura deve ser tratada num Stomacher ou Pulsifier durante aproximadamente um minuto (são necessários 27 g para realizar em paralelo, a partir de uma amostra, as análises para detecção de Salmonella spp. e de Campylobacter spp.). Deve evitar-se a formação de espuma, retirando a maior quantidade de ar possível do saco de Stomacher.

Esta suspensão inicial deve ser usada do seguinte modo:

a)	Devem ser transferidos 10 ml (~1g) para 90 ml de um meio de enriquecimento para detecção de Campylobacter spp.;

b)	Devem transferir-se 10 ml (~1g) para um tubo vazio esterilizado; é utilizado 1 ml para contagem de Campylobacter spp. em placas selectivas.

O resto da suspensão inicial (250 ml ~ 25g) deve ser utilizado para detecção de Salmonella spp.

2.4.   Métodos de detecção e identificação de Salmonella spp.

2.4.1.   Detecção de Salmonella spp.

A detecção de Salmonella spp. deve efectuar-se de acordo com a norma ISO 6579-2002 (E). «Microbiologia de alimentos para consumo humano e para alimentação animal — Método horizontal para a detecção de Salmonella spp.».

2.4.2.   Serotipagem de Salmonella spp.

O laboratório nacional de referência para Salmonella deve, para cada amostra positiva, fazer a tipagem de, pelo menos, um isolado utilizando o método de Kaufmann-White.

Para efeitos de garantia da qualidade, deve ser enviada ao laboratório comunitário de referência para Salmonella uma percentagem dos isolados não tipáveis, constituída por, no máximo, 16 isolados não tipáveis. Essa percentagem de isolados deve ser enviada ao laboratório trimestralmente.

2.4.3.   Fagotipagem de Salmonella spp.

Recomenda-se a fagotipagem de pelo menos um isolado de cada amostra positiva de S. Enteritidis e S. Typhimurium, usando o protocolo definido pela Health Protection Agency (HPA), Colindale, Londres.

2.5.   Métodos de detecção, identificação e quantificação de Campylobacter spp.

2.5.1.   Detecção de Campylobacter spp.

O isolamento e a confirmação dos organismos Campylobacter deve realizar-se de acordo com a norma ISO 10272-1:2006(E). Deve ser especiado pelo menos um isolado de Campylobacter por lote, utilizando-se métodos fenotípicos descritos na norma ISO 10272-1:2006(E) ou métodos moleculares publicados, como por exemplo as técnicas de reacção de polimerização em cadeia (PCR). Deve indicar-se o método utilizado.

Para efeitos de garantia da qualidade, deve ser enviada ao laboratório comunitário de referência para Campylobacter uma percentagem de isolados de Campylobacter spp. constituída por, no máximo, oito isolados para que se proceda à confirmação e à especiação.

Essa percentagem de isolados deve ser enviada ao laboratório trimestralmente. Se os isolados tiverem de ser transportados entre laboratórios, devem utilizar-se condições adequadas (por exemplo, meio de transporte com carvão).

2.5.2.   Quantificação de Campylobacter spp.

A detecção quantitativa de Campylobacter spp. deve efectuar-se de acordo com a norma ISO/TS 10272-2:2006 «Microbiologia de alimentos para consumo humano e para alimentação animal — Método horizontal para a detecção e contagem de Campylobacter spp. Parte 2: Técnica para a contagem de colónias». Partindo de 10 ml de suspensão inicial, examina-se 0,1 ml desta suspensão e de diluições subsequentes por forma a permitir uma contagem até 106 ufc/g. Além disso, examina-se 1 ml de suspensão inicial não diluída para obter um limite de contagem de 10 ufc/g. Todas as determinações em placa devem fazer-se em duplicado.

A fim de permitir a comparação e a apreciação correcta dos dados (em futuras avaliações dos riscos) deve estimar-se, em cada laboratório, a incerteza da medição (IM) do método de determinação quantitativa.

Para estimar a IM usa-se a especificação técnica ISO/TS 19036:2006, com a excepção de que, para esta estimativa, usam-se as diluições em paralelo da suspensão inicial.

A IM é derivada a partir do desvio padrão da reprodutibilidade interna do laboratório. Os dados para a estimativa da IM devem ser recolhidos entre Maio e Setembro para assegurar que se dispõe de amostras positivas. Devem examinar-se um total de 12 amostras positivas preparadas por diluição, em duplicado e em paralelo, a partir dos 10 ml de suspensão inicial. Os dados brutos da estimativa da IM devem ser comunicados em separado, como parte da descrição geral da implementação do estudo, tal como previsto na parte E.

3.   Armazenamento dos isolados

Recomenda-se o armazenamento de um subconjunto representativo de isolados a fim de permitir, por exemplo, uma análise posterior da susceptibilidade antimicrobiana. Armazena-se um isolado por cada amostra positiva. Deve dar-se preferência ao isolado de Campylobacter obtido a partir da análise quantitativa. Os isolados devem ser armazenados no LNR, recorrendo ao método normal para a colecção de culturas do LNR, desde que garanta a viabilidade das estirpes durante, pelo menos, dois anos.

PARTE E

Relatórios

Devem elaborar-se relatórios que incluam, no mínimo, as seguintes informações:

1.

Descrição geral da implementação de estudo — Matadouros: total por país e quantos foram objecto de amostragem; — Dimensão da amostra primária utilizada; — Descrição dos procedimentos de estratificação e aleatorização; — Descrição das actividades de controlo de qualidade, incluindo um relatório sobre as 12 estimativas da IM por laboratório para a quantificação de Campylobacter; — Resultados globais.

2.

Informações específicas relativamente aos dados de prevalência Os Estados-Membros devem apresentar os resultados do estudo sob a forma de dados em bruto, recorrendo a um dicionário de dados e às fichas de recolha de dados facultadas pela Comissão. Estes dados devem incluir, pelo menos: — Nome/código do matadouro; — Identificador do lote para bate; — Nome/código da exploração de origem do lote para abate; — Dimensão da exploração, se se souber; — Estatuto do bando em termos de vacinação contra Salmonella, se se souber; — Idade dos frangos aquando a amostragem (abate); — Informações sobre se se trata do primeiro ou de um lote subsequente a ser abatido no bando em causa (antes do despovoamento ou não); — Tipo de produção (ou seja, convencional, ao ar livre, biológica); — Resultados de anteriores testes para detecção de Salmonella e Campylobacter no mesmo bando; — Data da amostragem; — Número de aves abatidas por ano no mesmo matadouro; — Tipo de método de refrigeração utilizado (ar, imersão, spray); — Pormenores do protocolo de transporte (segundo especificado: S/N); — Data de recepção no laboratório; — Data de realização dos testes; — Identificação do laboratório; — Tipo de amostra; — Descrição dos métodos de cultura utilizados, em particular o ou os meios selectivos; — Isolado de Campylobacter: método utilizado para especiação; — Campylobacter: resultado dos testes bacteriológicos, incluindo a especiação a partir da amostra cecal; — Campylobacter: resultado dos testes bacteriológicos, incluindo a especiação e a quantificação a partir da amostra de carcaça; — Salmonella: resultado do teste bacteriológico e da serotipagem; — Tempo decorrido entre a colheita da amostra e a análise (por período de 12 h).

3.

Informações específicas relativamente ao teste de resistência antimicrobiana de isolados de Campylobacter de amostras cecais Os resultados da vigilância da resistência antimicrobiana devem ser avaliados e comunicados, em conformidade com o artigo 9.o da Directiva 2003/99/CE, no relatório anual sobre as tendências e origens das zoonoses, dos agentes zoonóticos e da resistência antimicrobiana. Sem prejuízo das disposições do anexo IV da Directiva 2003/99/CE, devem ser comunicadas as seguintes informações: — Origem dos isolados, ou seja, estudo de base, programa de controlo, vigilância passiva; — Número de isolados testados em termos de susceptibilidade, por espécie de Campylobacter; — Número de isolados detectados como resistentes, por agente antimicrobiano e por espécie de Campylobacter; e — Número de isolados totalmente susceptíveis e número de isolados resistentes a um, dois, três, quatro e a mais de quatro dos agentes antimicrobianos constantes do quadro 1, por espécie de Campylobacter.

---

(1)  Estimativa: número de explorações (4 na Estónia, 5 na Letónia) × 2 bandos por exploração × 2 lotes para abate por bando × 6 ciclos por ano. No Luxemburgo, apenas são abatidos frangos de 3 bandos pequenos. De três em três meses deve ser amostrado um lote para abate de cada um deles.

ANEXO II

Participação financeira máxima da Comunidade a atribuir aos Estados-Membros

(EUR)
Estado-Membro	Montante total máximo do co-financiamento de amostragens e análises
Bélgica - BE	58 092
Bulgária - BG	58 092
República Checa - CZ	58 092
Dinamarca - DK	58 092
Alemanha - DE	58 092
Estónia - EE	14 688
Irlanda - IE	58 092
Grécia - EL	58 092
Espanha - ES	58 092
França - FR	58 092
Itália - IT	58 092
Chipre - CY	58 092
Letónia - LV	18 360
Lituânia - LT	58 092
Luxemburgo - LU	1 836
Hungria - HU	58 092
Malta - MT	58 092
Países Baixos - NL	58 092
Áustria - AT	58 092
Polónia - PL	58 092
Portugal - PT	58 092
Roménia – RO	58 092
Eslovénia - SI	58 092
Eslováquia - SK	58 092
Finlândia - FI	58 092
Suécia - SE	58 092
Reino Unido - UK	58 092
Total	1 429 092

ANEXO III

Relatório financeiro certificado sobre a realização de um estudo sobre a prevalência e a resistência antimicrobiana de Campylobacter spp. em bandos de frangos e sobre a prevalência de Campylobacter spp. e de Salmonella spp. em carcaças de frangos

Período de incidência: de … a …

Declaração das despesas efectuadas com o estudo e elegíveis para participação financeira da Comunidade

Número de referência da decisão da Comissão relativa à participação financeira da Comunidade:

…

…

Despesas relativas a funções em/por	Número de testes	Despesas totais com a realização de testes efectuadas durante o período de incidência (moeda nacional)
Detecção bacteriológica de Campylobacter spp.
Detecção bacteriológica de Salmonella spp.
Confirmação de Campylobacter spp.
Especiação de isolados de Campylobacter
Contagem de isolados de Campylobacter
Serotipagem de isolados de Salmonella
Testes à resistência antimicrobiana de isolados de Campylobacter

Declaração do beneficiário

Certificamos que

—	as despesas referidas supra são verdadeiras e estão relacionadas com as tarefas definidas na decisão, tendo sido essenciais para a realização dessas tarefas;

—	todos os documentos justificativos das despesas estão disponíveis para efeitos de auditoria;

—	não foi solicitada mais nenhuma participação comunitária para este programa.

Data: …

Responsável financeiro: …

Assinatura: …