ANNEXE I

SPÉCIFICATIONS TECHNIQUES VISÉES À L’ARTICLE 4

PARTIE A

Base d’échantillonnage

Pour éviter les effets liés à l’âge, la surveillance est effectuée sur les lots d’abattage au sein de l’abattoir.

Les observations ayant montré que la prévalence de Campylobacter spp. variait considérablement selon la saison, il y a lieu de procéder à une stratification. À cette fin, une période de douze mois doit être divisée en douze périodes d’un mois. Un douzième de l’échantillon total doit être prélevé pour chacune de ces périodes.

Par ailleurs, l’échantillonnage doit se faire sur la base d’une sélection aléatoire, en ce qui concerne les abattoirs, les jours d’échantillonnage au cours de chaque mois et les lots devant faire l’objet d’un échantillonnage au cours d’une journée d’échantillonnage déterminée. Le plan de randomisation garantit, en particulier, que les lots d’abattage sont sélectionnés proportionnellement au nombre de troupeaux engraissés selon les différents types de production (conventionnel, libre parcours, biologique). En outre, la randomisation ne doit pas être influencée par le statut au regard de Salmonella spp. ou de Campylobacter spp., si celui-ci est connu au moment de l’abattage. L’autorité compétente se charge d’établir le plan de randomisation et de faire en sorte qu’il soit appliqué de manière appropriée. Un exemple de procédure de randomisation est présenté dans le rapport concernant la proposition de spécifications techniques pour un programme de surveillance coordonné de Salmonella et de Campylobacter dans la viande des poulets de chair au sein de l’Union européenne, rédigé par la task force de l’EFSA chargée de la collecte de données sur les zoonoses. Les détails du plan de randomisation sont communiqués à la Commission.

PARTIE B

Taille de l’échantillon

1.   Taille de l’échantillon primaire

a)	La taille de l’échantillon primaire fournit le nombre de lots d’abattage à tester.

b)	Au moins 384 lots d’abattage font l’objet d’un échantillonnage. Pour compenser par avance les possibles non-réponses, 10 % d’échantillons supplémentaires sont prélevés.

c)

Par dérogation au point b), les nombres suivants de lots d’abattage (1) font l’objet d’un échantillonnage, respectivement en Estonie, en Lettonie et au Luxembourg: i) 96 lots d’abattage au minimum en Estonie; ii) 120 lots d’abattage au minimum en Lettonie; iii) 12 lots d’abattage au minimum au Luxembourg.

2.   Taille de l’échantillon secondaire

La taille de l’échantillon secondaire fournit le nombre de poulets de chair à échantillonner par lot d’abattage. Ce nombre sera de dix oiseaux pour la détection de Campylobacter dans les cæcums et d’un oiseau pour la détection de Campylobacter et de Salmonella dans les carcasses. Ces échantillons de cæcums et de carcasse doivent provenir du même lot d’abattage.

PARTIE C

Prélèvement, traitement et analyse des échantillons en vue de la détection de Campylobacter spp. dans les troupeaux de poulets de chair et pour la détermination de sa résistance antimicrobienne

1.   Collecte et transport

Les campylobacters sont des organismes relativement fragiles, qui meurent rapidement une fois sortis de l’intestin hôte. C’est pourquoi il convient de veiller à ce que les échantillons soient prélevés de manière appropriée et analysés rapidement. Les températures extrêmes sont à éviter et le transport doit être aussi rapide que possible.

Les échantillons à prélever sont les cæcums intacts. Les échantillons cæcaux sont prélevés au moment de l’éviscération.

Seul du personnel formé aux procédures d’échantillonnage standard est habilité à collecter les échantillons. L’objectif principal est de limiter autant que possible une contamination externe par le contenu du cæcum lors de la prise d’échantillons. Le meilleur moyen d’atteindre cet objectif est d’opérer avec précaution une traction manuelle à la jonction avec l’intestin. Un cæcum intact par oiseau est prélevé, et les échantillonneurs vérifient que ce cæcum est plein; dans le cas contraire, il n’est pas pris en considération. Les échantillons sont de préférence pris au hasard dans le lot sur des oiseaux qui ne se suivent pas (en évitant la première partie du lot d’abattage). Les dix cæcums prélevés peuvent être placés dans un sac/emballage stérile unique pour le transport.

Toutes les informations utiles concernant l’échantillon doivent être portées sur un formulaire d’échantillonnage fourni par l’autorité compétente afin que soient respectées les exigences de notification décrites dans la partie E. Un seul et même numéro doit être étiqueté sur chaque échantillon et sur le formulaire qui l’accompagne; ce numéro doit être conservé depuis l’échantillonnage jusqu’à l’analyse. L’autorité compétente doit veiller à la mise en place et à l’utilisation d’un système de numérotation unique. L’identifiant du lot d’abattage est également utilisé pour l’échantillon de carcasse.

Les échantillons cæcaux sont transportés au laboratoire sous la forme de cæcums intacts dans un délai de 24 heures (par envois postaux express ou par service de messagerie) et sont analysés immédiatement. Dans les cas où cela n’est pas réalisable, les échantillons sont conservés réfrigérés au moins jusqu’à leur transport au laboratoire et sont analysés au plus tard entre 72 et 80 heures après leur prélèvement. Au laboratoire, les échantillons qui ne peuvent pas être analysés le jour de leur arrivée sont conservés réfrigérés jusqu’au moment de l’analyse.

Au laboratoire, les contenus cæcaux sont retirés dans des conditions d’asepsie et rassemblés en un échantillon composite.

2.   Méthode de diagnostic

2.1.   Culture

La culture directe en milieu sélectif fournit une bonne estimation de la prévalence de campylobacters. La culture directe de l’échantillon est effectuée dans un milieu sélectif adapté à Campylobacter [milieu sélectif modifié pour Campylobacter, exempt de sang (CCDA); Karmali; ou gélose Preston].

Les boîtes sont incubées à 41,5 ± 1 °C, dans une atmosphère microaérophile pendant au moins 48 +/– 2 heures. Une croissance peut être détectée après 24 heures.

L’atmosphère de microaérophilie peut être obtenue dans des incubateurs microaérophiles disponibles dans le commerce (mélange gazeux à 10 % CO2/6 % O2). En l’absence de tels incubateurs, il est possible d’utiliser des systèmes de culture microaérophile, c’est-à-dire des jarres de gaz. Des systèmes d’emballages sous gaz fournissant l’atmosphère microaérophile appropriée sont disponibles sur le marché.

Des témoins positifs et négatifs adéquats sont inclus dans chaque lot d’échantillons mis en culture.

2.2.   Confirmation et spéciation du genre Campylobacter

L’isolement et la confirmation des germes de Campylobacter doivent être effectués selon les méthodes décrites dans la norme ISO 10272-1:2006(E). Un isolat de Campylobacter par lot au minimum doit être spécifié en utilisant les méthodes phénotypiques décrites dans la norme ISO 10272-1:2006(E) ou des méthodes moléculaires publiées, telles que les techniques d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) La méthode utilisée doit être indiquée. L’isolat spécifié doit être utilisé pour les tests ultérieurs de résistance aux antimicrobiens.

Dans l’hypothèse où un laboratoire a moins d’expérience dans les méthodes de spéciation, il stocke l’isolat conformément aux prescriptions du point 2.4, en attendant de bénéficier d’une formation complémentaire, ou l’envoie à un laboratoire plus expérimenté après consultation du laboratoire communautaire de référence pour Campylobacter.

2.3.   Contrôle de la qualité

Aux fins de l’assurance qualité, un certain nombre d’isolats de Campylobacter spp. — huit au maximum — sont envoyés au laboratoire communautaire de référence pour Campylobacter en vue de la confirmation et de la spéciation.

Une partie de ces isolats est envoyée au LCR, soit en un seul lot, soit sur une base trimestrielle. Si des isolats doivent être transportés d’un laboratoire à un autre, les conditions appropriées à ce transport doivent être réunies (utilisation d’écouvillons au charbon, par exemple).

2.4.   Stockage

Au moins un isolat par échantillon positif est stocké dans les laboratoires de référence nationaux conformément à la méthode normale utilisée pour la collection de cultures des LRN, sous réserve qu’elle garantisse la viabilité des souches pendant au moins deux années.

2.5.   Évaluation de la résistance antimicrobienne

Le nombre d’isolats de Campylobacter sur lequel doit porter la surveillance de la résistance antimicrobienne par État membre est de 170. La surveillance porte au maximum sur un isolat par espèce de Campylobacter provenant du même lot d’abattage.

Dans les États membres où, une année donnée, le nombre d’isolats est inférieur à l’échantillon cible, la surveillance de la résistance antimicrobienne porte sur tous les isolats disponibles.

Dans les États membres où le nombre d’isolats disponibles est supérieur à l’échantillon cible, la surveillance porte sur tous les isolats ou sur une sélection aléatoire représentative d’un nombre d’isolats égal ou supérieur à l’échantillon cible.

Les États membres testent au moins les antimicrobiens figurant au tableau 1 en utilisant les valeurs seuils mentionnées et une plage de concentrations appropriée pour déterminer la sensibilité de Campylobacter aux antimicrobiens.

Tableau 1

	Antimicrobien	Valeur seuil (mg/l) P >
Campylobacter Jejuni	Érythromycine	4
	Ciprofloxacine	1
	Tétracycline	2
	Streptomycine	2
	Gentamicine	1
Campylobacter Coli	Érythromycine	16
	Ciprofloxacine	1
	Tétracycline	2
	Streptomycine	4
	Gentamicine	2

Les méthodes par dilution sont appliquées conformément aux méthodes décrites dans les lignes directrices M31-A3 — troisième édition, «Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals» et M100-S16, «Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing»; Sixteenth International Supplement, du CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

PARTIE D

Prélèvement, traitement et analyse des échantillons en vue de la détection de Campylobacter spp. et de Salmonella spp. dans les carcasses de poulets de chair

1.   Collecte et transport

Une carcasse complète par lot d’abattage est prélevée immédiatement après réfrigération mais avant tout autre traitement, comme la congélation, la découpe ou le conditionnement. Cela signifie que dans certains abattoirs, les échantillons peuvent être prélevés après préréfrigération lorsque celle-ci constitue la dernière étape avant tout traitement ultérieur.

L’échantillon recueilli est placé dans un sac en plastique stérile distinct, en évitant les contaminations croisées, et est envoyé au laboratoire qui procède à l’échantillonnage de la peau.

Il faut éviter toute contamination croisée par d’autres échantillons de carcasses ou de cæcums lors de la collecte des carcasses. Des précautions doivent donc être prises à toutes les étapes afin d’éviter toute contamination des équipements utilisés au cours de l’échantillonnage, du transport et du stockage par les agents pathogènes qui font l’objet de l’étude.

Toutes les informations pertinentes concernant l’échantillon doivent être portées sur un formulaire d’échantillonnage fourni par l’autorité compétente afin que soient respectées les exigences de notification décrites dans la partie E.

Un seul et même numéro doit être étiqueté sur chaque échantillon et sur le formulaire qui l’accompagne; ce numéro doit être conservé depuis l’échantillonnage jusqu’à l’analyse. L’autorité compétente doit veiller à la mise en place et à l’utilisation d’un système de numérotation unique. L’identifiant du lot d’abattage est également utilisé pour les échantillons de cæcums.

Durant le transport, les échantillons sont conservés à une température entre + 2 et 8 °C et à l’abri de toute contamination extérieure.

Idéalement, tous les échantillons doivent parvenir au laboratoire dans les 24 heures qui suivent l’échantillonnage. Dans des situations exceptionnelles (longs trajets, week-ends ou jours fériés, par exemple), ce délai peut être porté à 80 heures.

Lorsqu’il est fait appel à différents laboratoires pour les recherches de Campylobacter et de Salmonella, le laboratoire chargé de détecter la présence de Campylobacter devrait être prioritaire pour la livraison des échantillons.

2.   Échantillonnage en laboratoire et méthodes d’analyse

2.1.   Réception des échantillons

Au moment de la réception des échantillons, les laboratoires vérifient les informations consignées par l’échantillonneur et complètent les rubriques pertinentes du formulaire d’échantillonnage.

Les échantillons sont conservés au laboratoire à une température de + 2 à 8 °C; la procédure d’échantillonnage en laboratoire commence dès que possible après réception des échantillons et, en tout état de cause, dans les 72 à 80 heures suivant la prise des échantillons.

2.2.   Préparation des échantillons

Tous les échantillons réceptionnés font l’objet d’un examen visant à vérifier l’intégrité des emballages de transport avant le début des tests.

À chaque étape, les personnes chargées de la manipulation doivent éviter toute contamination croisée entre échantillons ou par l’environnement immédiat.

Munies de gants jetables, elles retirent le poulet du sac d’échantillonnage, en veillant à ne pas contaminer l’enveloppe extérieure de l’animal.

À l’aide d’un instrument stérile et d’une technique aseptique, la peau du cou, si elle est présente, est enlevée ainsi que la peau d’un côté de la carcasse, en évitant les parties grasses, de manière à obtenir une fraction à analyser de 27 g, qui est placée dans un sac Stomacher (ou un Pulsifier).

2.3.   Suspension mère

La fraction à analyser de 27 g est ajoutée à neuf volumes (243 ml) d’eau peptonée tamponnée, portée préalablement à température ambiante. Ce mélange est traité dans un Stomacher ou un Pulsifier pendant environ une minute (27 g sont nécessaires pour pouvoir rechercher parallèlement Salmonella spp. et Campylobacter spp. à partir d’un seul échantillon). La formation de mousse est évitée en évacuant autant que possible l’air du sac Stomacher.

La suspension mère est utilisée comme suit:

a)	10 ml (~1 g) sont ajoutés à 90 ml d’un milieu d’enrichissement pour la détection de Campylobacter spp.;

b)	10 ml (~1 g) sont versés dans un tube stérile vide; 1 ml est utilisé pour le dénombrement de Campylobacter spp. sur des boîtes sélectives.

Le reste de la suspension mère (250 ml ~ 25 g) est utilisé pour la détection de Salmonella spp.

2.4.   Méthodes de détection et d’identification de Salmonella spp.

2.4.1.   Détection de Salmonella spp.

La détection de Salmonella spp. est réalisée selon la norme ISO 6579-2002 (E). «Microbiologie des aliments — méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp.»

2.4.2.   Sérotypage de Salmonella spp.

Au moins un isolat de chaque échantillon positif doit faire l’objet d’un typage par le laboratoire de référence national (LRN) pour Salmonella, selon la classification de Kaufmann-White.

À des fins d’assurance qualité, une partie des isolats non typables est envoyée au laboratoire communautaire de référence pour Salmonella, cet envoi étant limité à seize isolats non typables. Une partie de ces isolats est envoyée au LCR sur une base trimestrielle.

2.4.3.   Lysotypie de Salmonella spp.

Pour S. Enteritidis et S. Typhimurium, il est recommandé de procéder à la lysotypie d’au moins un isolat de chaque échantillon positif en utilisant le protocole défini par l’Agence britannique pour la protection de la santé (Health Protection Agency — HPA), Colindale, Londres.

2.5.   Méthodes de détection, d’identification et de quantification pour Campylobacter spp.

2.5.1.   Détection de Campylobacter spp.

L’isolement et la confirmation des germes de Campylobacter doivent être effectués selon les méthodes décrites dans la norme ISO 10272-1:2006(E). Un isolat de Campylobacter au minimum par lot doit être spécifié en utilisant les méthodes phénotypiques décrites dans la norme ISO 10272-1:2006(E) ou des méthodes moléculaires publiées, telles que les techniques d’amplification en chaîne par polymérase (PCR). La méthode utilisée doit être indiquée.

À des fins d’assurance qualité, un certain nombre d’isolats de Campylobacter spp. – huit au maximum – sont envoyés au laboratoire communautaire de référence pour Campylobacter en vue de la confirmation et de la spéciation.

Une partie de ces isolats est envoyée au LCR sur une base trimestrielle. Si des isolats doivent être transportés d’un laboratoire à un autre, les conditions appropriées à ce transport doivent être réunies (utilisation d’écouvillons au charbon, par exemple).

2.5.2.   Quantification de Campylobacter spp.

La détection quantitative de Campylobacter spp. est réalisée conformément aux spécifications techniques ISO/TS 10272-2:2006: «Microbiologie des aliments – méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Campylobacter spp. Partie 2: technique par comptage des colonies.» À partir de 10 ml de suspension mère, 0,1 ml de cette suspension et des dilutions supplémentaires est examiné afin de permettre le dénombrement de 106 UFC/g maximum. En outre, 1 ml de suspension mère non diluée est examiné en vue d’obtenir une limite de dénombrement de 10 UFC/g. Toutes les déterminations sur boîte sont réalisées en double.

Afin de permettre une comparaison et une appréciation correctes des données (en vue d’une future évaluation des risques), l’incertitude de mesure (IM) de la méthode de détermination quantitative est estimée pour chaque laboratoire.

Il est procédé à l’estimation de l’IM sur la base de la spécification technique ISO/TS 19036:2006, à ceci près que l’estimation de l’incertitude de mesure se fait à partir des dilutions parallèles de la suspension mère.

L’IM est calculée à partir de l’écart type de reproductibilité intra-laboratoire. Les données relatives à l’estimation de l’IM sont collectées de mai à septembre afin de garantir des échantillons positifs. Un ensemble de douze échantillons positifs est examiné deux foi, et des dilutions parallèles sont préparées à partir des 10 ml de suspension mère. Les données brutes relatives à l’estimation de l’IM sont indiquées séparément comme un des éléments de la description globale de la mise en œuvre de l’étude selon les modalités décrites dans la partie E.

3.   Stockage des isolats

Afin de permettre, par exemple, des tests ultérieurs de la sensibilité aux antimicrobiens, il est recommandé de stocker un sous-ensemble représentatif d’isolats. Un isolat par échantillon positif est stocké. La préférence va à l’isolat de Campylobacter obtenu par l’analyse quantitative. Les isolats doivent être stockés dans les laboratoires de référence nationaux conformément à la méthode normale utilisée pour la collection de cultures des LRN, sous réserve qu’elle garantisse la viabilité des souches pendant au moins deux années.

PARTIE E

Rapports

Les rapports contiennent au moins les informations suivantes:

1)

Description globale de la mise en œuvre de l’étude: — abattoirs: nombre total par pays et nombre d’abattoirs échantillonnés, — taille de l’échantillon primaire, — description des procédures de stratification et de randomisation, — description des activités de contrôle de la qualité, y compris un compte rendu des douze estimations de l’IM réalisées par laboratoire en ce qui concerne la quantification de Campylobacter, — résultats globaux.

(2)

Informations spécifiques concernant les données sur la prévalence Les États membres soumettent les résultats de leurs recherches sous la forme de données brutes en utilisant le dictionnaire de données et les formulaires de collecte des données fournis par la Commission. Ces données comprennent au minimum les informations suivantes: — nom/code de l’abattoir, — identifiant du lot d’abattage, — nom/code de l’exploitation (élevage) d’origine du lot d’abattage, — taille de l’exploitation, si cette information est disponible, — statut vaccinal du troupeau vis-à-vis des salmonelles, si disponible, — âge des poulets de chair au moment de l’échantillonnage (abattage), — le lot d’abattage concerné était-il le premier ou un des lots d’abattage ultérieurs issus de ce même troupeau (avant détassage ou non), — type de production (conventionnel, libre parcours, biologique), — résultats de recherches antérieures de Salmonella et Campylobacter dans le même troupeau, — date de l’échantillonnage, — nombre d’oiseaux abattus par an dans l’abattoir concerné, — type de méthode de réfrigération utilisée (à l’air, par immersion, par aspersion), — détails du protocole de transport (tels que spécifiés: O/N), — date de réception par le laboratoire, — date de l’analyse, — identification du laboratoire, — type d’échantillon, — description des méthodes de culture utilisées, notamment du ou des milieux sélectifs, — isolat de Campylobacter: méthode de spéciation utilisée, — Campylobacter: résultats des tests bactériologiques, y compris de la spéciation à partir de l’échantillon cæcal, — Campylobacter: résultats des tests bactériologiques, y compris de la spéciation et de la quantification à partir de l’échantillon de carcasse, — Salmonella: résultat des tests bactériologiques et du sérotypage, — période écoulée entre l’échantillonnage et l’analyse (par période de douze heures).

3)

Informations spécifiques concernant la recherche d’une résistance antimicrobienne des isolats de Campylobacter provenant d’échantillons cæcaux. Les résultats de la surveillance de la résistance antimicrobienne sont évalués et consignés, conformément à l’article 9 de la directive 2003/99/CE, dans le rapport annuel sur les tendances et les sources des zoonoses, des agents zoonotiques et de la résistance antimicrobienne. Sans préjudice des dispositions de l’annexe IV de la directive 2003/99/CE, les informations suivantes doivent être communiquées: — origine des isolats (étude de référence, programme de contrôle, surveillance passive), — nombre d’isolats par espèce de Campylobacter dont la sensibilité a été testée, — nombre d’isolats qui se sont révélés résistants par antimicrobien et par espèce de Campylobacter, et — nombre d’isolats totalement sensibles et nombre d’isolats résistants à 1, 2, 3, 4 et > 4 antimicrobiens figurant au tableau 1, par espèce de Campylobacter.

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(1)  Estimation: nombre d’exploitations (4 en Estonie, 5 en Lettonie) × 2 troupeaux par exploitation × 2 lots d’abattage par troupeau × 6 séries par an. Au Luxembourg, seuls 3 petits troupeaux fournissent des poulets de chair à l’abattage. Dans chacun d’eux, un lot d’abattage est échantillonné chaque trimestre.

ANNEXE II

Participation financière maximale accordée par la Communauté aux États membres

(EUR)
État membre	Montant total maximal de cofinancement prévu pour l’échantillonnage et les analyses
Belgique – BE	58 092
Bulgarie – BG	58 092
République tchèque – CZ	58 092
Danemark – DK	58 092
Allemagne – DE	58 092
Estonie – EE	14 688
Irlande – IE	58 092
Grèce – EL	58 092
Espagne – ES	58 092
France – FR	58 092
Italie – IT	58 092
Chypre – CY	58 092
Lettonie – LV	18 360
Lituanie – LT	58 092
Luxembourg – LU	1 836
Hongrie – HU	58 092
Malte – MT	58 092
Pays-Bas – NL	58 092
Autriche – AT	58 092
Pologne – PL	58 092
Portugal – PT	58 092
Roumanie – RO	58 092
Slovénie – SI	58 092
Slovaquie – SK	58 092
Finlande – FI	58 092
Suède – SE	58 092
Royaume-Uni – UK	58 092
Total	1 429 092

ANNEXE III

Rapport financier certifié sur la mise en œuvre d’une étude sur la prévalence et la résistance antimicrobienne de Campylobacter spp. dans les troupeaux de poulets de chair ainsi que sur la prévalence de Campylobacter spp. et de Salmonella spp. dans les carcasses de poulets de chair

Période de référence: du … au …

Déclaration des dépenses supportées pour l’étude pouvant bénéficier de la participation financière de la Communauté

Numéro de référence de la décision de la Commission accordant une participation financière de la Communauté:

…

…

Dépenses supportées en rapport avec	Nombre de tests	Total des dépenses supportées pour les tests pendant la période de référence (en monnaie nationale)
Détection bactériologique de Campylobacter spp.
Détection bactériologique de Salmonella spp.
Confirmation de Campylobacter spp.
Spéciation d’isolats de Campylobacter
Dénombrement d’isolats de Campylobacter
Sérotypage d’isolats de Salmonella
Recherche de résistances antimicrobiennes dans les isolats de Campylobacter

Déclaration du bénéficiaire

Nous certifions:

—	que les dépenses susmentionnées sont réelles, qu’elles ont été exposées lors de la réalisation des tâches définies dans la présente décision et qu’elles étaient indispensables à la bonne exécution desdites tâches,

—	que toutes les pièces justificatives de ces dépenses sont disponibles à des fins de contrôle,

—	qu’aucune autre participation communautaire n’a été demandée pour ce programme.

Date: …

Responsable financier: …

Signature: …