PRILOGA I

TEHNIČNE SPECIFIKACIJE IZ ČLENA 4

DEL A

Vzorčenje

Da bi se izognili učinkom staranja, se spremljanje klavnih serij izvede v klavnicah.

Ker se razširjenost Campylobacterja spp. bistveno spreminja glede na letni čas, je treba opraviti stratifikacijo. Za ta namen se mora dvanajstmesečno obdobje razdeliti v dvanajst obdobij po en mesec. V vsakem od teh obdobij se mora odvzeti dvanajstina celotne velikosti vzorca.

Vzorčenje mora temeljiti na naključnem izboru, kar velja za klavnice, dneve vzorčenja v mesecu in serije za vzorčenja na izbrani dan vzorčenja. Shema naključnega izbiranja zlasti zagotavlja izbor klavnih serij v razmerju s številom jat, rejenih na različne načine reje (konvencionalna, prosta, ekološka). Če je ob zakolu znan status Salmonelle spp. ali Campylobacterja spp., ta ne sme vplivati na naključni izbor. Pristojni organ prevzame odgovornost za oblikovanje sheme naključne izbire in zagotovitev njene pravilne izvedbe. Primer postopka naključne izbire je opisan v Poročilu delovne skupine EFSA o podatkovni zbirki za zoonoze, ki vsebuje predloge o tehničnih specifikacijah za usklajene programe spremljanja salmonele in kampilobakterja v mesu pitovnih piščancev v EU. Podatki o shemi naključnega izbora se sporočijo Komisiji.

DEL B

Velikost vzorca

1.   Velikost primarnega vzorca

(a)	Velikost primarnega vzorca določa število klavnih serij, ki jih je treba testirati.

(b)	Vzorči se vsaj 384 klavnih serij. Da se upoštevajo morebitne napake vzorčenja, se vzorči prbližno 10 % vzorcev več, kakor je določeno.

(c)	Z odstopanjem od točke (b) se v Estoniji, Latviji in Luksemburgu vzorči naslednje število klavnih serij (1): (i) v Estoniji vsaj 96 klavnih serij; (ii) v Latviji vsaj 120 klavnih serij; (iii) v Lusemburgu vsaj 12 klavnih serij.

2.   Velikost sekundarnega vzorca

Velikost sekundarnega vzorca je število posameznih pitovnih piščancev na klavno serijo, ki jih je treba vzorčiti. Za odkrivanje kampilobakterja v slepem črevesu je to število 10 piščancev in 1 piščanec za odkrivanje kampilobakterja in salmonele v truplih. Vzorci iz slepega črevesa in trupel morajo biti iz iste klavne serije.

DEL C

Zbiranje, obdelava in analiza vzorcev za odkrivanje Camplobacterja spp. v jatah pitovnih piščancev in testiranje protimikrobne občutljivosti

1.   Zbiranje in prevoz

Kampilobakterji so relativno šibki organizmi, ki hitro poginejo izven črevesa gostitelja. Zato je treba poskrbeti, da se zagotovi ustrezen odvzem vzorcev in njihova hitra analiza. Treba se je izogibati ekstremnim temperaturam, prevoz pa mora biti čim hitrejši.

Vzorci se odvzamejo iz nepoškodovanega slepega črevesa. Vzorci slepega črevesa se odvzamejo ob odstranitvi drobovja.

Vzorce odvzame le osebje, ki je usposobljeno za standardne postopke vzorčenja. Glavni cilj je v največji meri zmanjšati zunanje onesnaženje z vsebino slepega črevesa med vzorčenjem. To je najlaže doseči s previdnim manualnim vlekom na mestu stika s črevesom. Na piščanca je treba odvzeti eno nepoškodovano slepo črevo, osebje, ki vzorči, pa potrdi, da je slepo črevo polno, v nasprotnem se ga ne upošteva. Po možnosti je treba naključno vzorčiti celotno serijo piščancev (izpustiti je treba prvi del klavne serije), pri čemer je treba vzorce odvzeti po nezaporednem vrstnem redu. 10 zbranih slepih čreves se lahko shrani v posamezne sterilne vrečke/zavitke za prevoz.

Da se omogoči izpolnitev vseh zahtev za poročanje iz dela E, je treba vse pomembne razpoložljive informacije o vzorcu vnesti v obrazec za vzorčenje, ki ga pripravi pristojni organ. Vsak vzorec in ustrezni obrazec za vzorčenje morata biti označena z enotno številko, ki se mora uporabljati od vzorčenja do testiranja. Pristojni organ mora zagotoviti vzpostavitev in uporabo sistema enotnega številčenja. Za vzorec trupla se uporablja ista identifikacijska številka kot za klavno serijo.

Vzorci slepega črevesa se kot nepoškodovano slepo črevo dostavijo v laboratorij v 24 urah (npr. z nočno pošto ali dostavo), kjer se takoj analizirajo. Ko tega ni možno izvesti, je treba vzorce hladiti na hladnem vsaj do prevoza do laboratorija, analizirati pa jih je treba najpozneje v 72–80 urah po vzorčenju. Vzorci, ki jih v laboratoriju ni možno testirati na dan prihoda, se hranijo na hladnem do analize.

V laboratoriju se aseptično odstrani vsebina slepega črevesa, iz katere se izdela en sestavljeni vzorec.

2.   Diagnostična metoda

2.1   Kultura

Direktna kultura na selektivnem gojišču zagotavlja dobro oceno razširjenosti kampilobakterjev. Direktna kultura vzorca se izvede na selektivnem gojišču, primernem za kampilobakter (tj. spremenjeno brezkrvno selektivno gojišče za kampilobakter (CCDA), Karmali ali Preston Agar).

Plošče se inkubira pri 41,5 ± 1 °C v mikroaerobni atmosferi vsaj 48 +/- 2 uri. Rast se lahko ugotovi po 24 urah.

Mikroaerobna atmosfera se lahko ustvari v mikroaerobnih inkubatorjih (plinska mešanica 10 % CO2/6 % O2), ki so dostopni na trgu. Če takšnih inkubatorjev ni na trgu, se lahko uporabijo sistemi za mikroaerobno kulturo (npr. plinske posode). Plinski sistemi za shranjevanje, ki zagotavljajo ustrezno mikroaerobno atmosfero, so dostopni na trgu.

Pri vsaki seriji vzorcev, iz katere se sestavi kultura, je treba predvideti ustrezne pozitivne in negativne kontrole.

2.2   Potrditev in speciacija rodu Campylobacter

Izolacijo in potrditev organizmov Campylobacter je treba opraviti, kakor je opisano v standardu ISO 10272-1:2006(E). Vsaj en izolat kampilobakterja na serijo mora biti speciiran z uporabo metod fenotipizacije, kakor je opisano v standardu ISO 10272-1:2006(E), ali objavljenih molekularnih metod, kot so tehnike verižne reakcije s polimerazo (PCR). Navede se uporabljena metoda. Speciiran izolat se uporabi za nadaljnje testiranje protimikrobne občutljivosti.

Če je laboratorij manj izkušen pri speciaciji, shrani izolate do dodatnega izobraževanja, kakor je določeno v odstavku 2.4, ali jih pošlje izkušenejšemu laboratoriju, ki se posvetuje z referenčnim laboratorijem Skupnosti za kampilobakter.

2.3   Nadzor kakovosti

Za zagotovitev kakovosti se v referenčni laboratorij Skupnosti za kampilobakter v potrditev in speciacijo pošlje delež izolatov Campylobacterja spp. (največ 8).

Delež teh izolatov se pošlje v navedeni laboratorij v posamezni seriji ali vsako četrtletje. Pri prevozu izolatov med laboratoriji se upoštevajo ustrezni pogoji (npr. brisi oglja).

2.4   Skladiščenje

Vsaj en izolat na pozitiven vzorec se shrani pri NRL z uporabo normalne metode NRL za zbiranje kultur, dokler ta zagotovlja obstoj sevov vsaj dve leti.

2.5   Testiranje protimikrobne odpornosti

V spremljanje protimikrobne odpornosti se vključi 170 izolatov kampilobakterja na državo članico. V spremljanje se ne vključi več kot en izolat na vrsto kampilobakterja iz iste klavne serije.

V tistih državah članicah, kjer je v danem letu na voljo manjše število izolatov kot je ciljna velikost vzorca, se vsi izolati vključijo v spremljanje protimikrobne odpornosti.

V tistih državah članicah, v katerih je na voljo več izolatov, se vključijo vsi izolati ali reprezentativno naključno izbrano število, ki je enako ali večje kot ciljna velikost vzorca.

Države članice opravijo teste vsaj za protimikrobna sredstva, ki so določena v razpredelnici 1, pri čemer uporabijo presečne vrednosti in ustrezna območja koncentracije za določitev občutljivosti kampilobakterja.

Razpredelnica 1

	Protimikrobno sredstvo	Presečna vrednost (mg/L) R >
Campylobacter jejuni	eritromicin	4
	ciprofloksacin	1
	tetraciklin	2
	streptomicin	2
	gentamicin	1
Campylobacter coli	eritromicin	16
	ciprofloksacin	1
	tetraciklin	2
	streptomicin	4
	gentamicin	2

Metode razredčitve se opravijo v skladu z metodami, opisanimi v Smernicah Inštituta za klinične in laboratorijske standarde (CLSI) M31 – A3 – 3. izdaja, objavljenimi v Standardih zmogljivosti za testiranje protimikrobne odpornosti, Standardi zmogljivosti za testiranje protimikrobne občutljivosti na disku in v razredčitvi za bakterije, izolirane iz živali in M100 – S16; Šestnajsta mednarodna priloga.

DEL D

Zbiranje, obdelava in analiza vzorcev za odkrivanje Campylobacterja spp. in Salmonelle spp. v truplih pitovnih piščancev

1.   Zbiranje in prevoz

Eno celotno truplo na klavno serijo se zbere takoj po ohladitivi, vendar pred nadaljnjimi postopki obdelave, kot so zamrznitev, razsek ali pakiranje. V nekaterih klavnicah to lahko pomeni, da so vzorci odvzeti po predhodnem hlajenju, če ta predstavlja zadnji korak pred nadaljnjo obdelavo.

Zbrani vzorec se shrani v ločeno sterilno plastično vrečko, da bi se izognili navzkrižnemu onesnaženju, in se pošlje v laboratorij, kjer se opravi vzorčenje kože.

Med zbiranjem trupel se je treba izogibati navzkrižnemu onesnaženju z drugimi trupli ali vzorci slepega črevesa. Zato je na vseh stopnjah potrebna previdnost, da se zagotovi, da se oprema, ki se uporablja med vzorčenjem, prevozom in skladiščenjem, ne onesnaži s patogeni, ki jih raziskava preučuje.

Da se omogoči izpolnitev vseh zahtev za poročanje iz dela E, je treba vse pomembne razpoložljive informacije o vzorcu vnesti v obrazec za vzorčenje, ki ga pripravi pristojni organ.

Vsak vzorec in ustrezni obrazec za vzorčenje morata biti označena z enotno številko, ki se mora uporabljati od vzorčenja do testiranja. Pristojni organ mora zagotoviti vzpostavitev in uporabo sistema enotnega številčenja. Za vzorec slepega črevesa se uporablja ista identifikacijska številka kot za klavno serijo.

Vzorci se hranijo pri temperaturi od + 2 do 8 °C in se med prevozom ne smejo onesnažiti od zunaj.

V idealnih razmerah naj bi bili vsi vzorci dostavljeni v laboratorij v 24 urah po vzorčenju. V izjemnih situacijah (npr. dolgotrajen prevoz, konec tedna ali državni prazniki) se to obdobje lahko podaljša do 80 ur.

Če teste za kampilobakter in salmonelo opravljata različna laboratorija, potem ima laboratorij, ki opravlja teste za kampilobakter, prednost pri prejemu vzorca.

2.   Vzorčenje v laboratoriju in analitske metode

2.1   Sprejem vzorca

Laboratoriji pri sprejemu vzorca pregledajo informacije, ki jih je označila oseba, ki je vzorčila, in izpolnijo ustrezne oddelke obrazca za vzorčenje.

Vzorce se v laboratoriju hrani pri temperaturi od + 2 do 8 °C, postopek vzorčenja v laboratoriju pa se začne takoj po prihodu vzorcev v laboratorij, v vsakem primeru pa v 72 do 80 urah po vzorčenju.

2.2   Priprava vzorca

Vsi prejeti vzorci se pregledajo, da se zagotovi, ali je prevozna embalaža pred testiranjem nepoškodovana.

Osebje, ki dela z vzorci, se mora na vseh stopnjah izogibati navzkrižnemu onesnaženju med vzorci in okoljem.

Piščanec se odstrani iz vrečke za vzorec z uporabo rokavic za enkratno uporabo, hkrati pa je potrebna previdnost, da se zunanja površina piščanca ne onesnaži.

Da se sestavi 27 gramski testni delec, je treba z uporabo sterilnega instrumenta in z aseptično tehniko odstraniti kožo ene strani trupla skupaj s kožo vratu, če je prisotna, po možnosti brez maščobe, testni delec pa se shrani v stomacher vrečko (ali pulsifier).

2.3   Začetna suspenzija

27 g težek testni delec se prenese v 9 volumnov (243 ml) peptonske vode, katere temperatura pred dodajanjem je enaka sobni temperaturi. Mešanico se obdela v stomacher ali pulsifier vrečki približno 1 minuto (za hkratno izvedbo analize za Salmonello spp. in Campylobacter spp. iz enega vzorca je potrebnih 27 g vzorca). Penjenju se izognemo tako, da se iz stomacher vrečke odstrani čim več zraka.

Ta začetna suspenzija se uporabi na naslednji način:

(a)	10 ml (~1 g) se prenese v 90 ml obogatenega gojišča za odkrivanje Campylobacterja spp;

(b)	10 ml (~1 g) se prenese v prazno sterilno cevko, 1 ml pa se uporabi za štetje Campylobacterja spp. na selektivnih ploščah.

Ostanek začetne supsenzije (250 ml ~ 25 g) se uporabi za odkrivanje Salmonelle spp.

2.4   Metode odkrivanja in identifikacije Salmonelle spp.

2.4.1   Odkrivanje Salmonelle spp.

Odkrivanje Salmonelle spp. se opravi v skladu s standardom ISO 6579-2002 (E). „Mikrobiologija živilskih in krmnih snovi – Horizontalna metoda za odkrivanje Salmonelle spp.“

2.4.2   Serotipizacija Salmonelle spp.

Vsaj en izolat vsakega pozitivnega vzorca tipizira nacionalni referenčni laboratorij za salmonelo z uporabo sheme po Kaufmann-White.

Za zagotovitev kakovosti se del izolatov (največ 16), ki jih ni možno tipizirati, pošlje v referenčni laboratorij Skupnosti za salmonelo. Del teh izolatov se vsako četrtletje pošlje v referenčni laboratorij Skupnosti.

2.4.3   Tipizacija fagov Salmonelle spp.

Za S. Enteritidis in S. Typhimurium je priporočljivo, da se opravi tipizacija fagov vsaj enega izolata iz vsakega pozitivnega vzorca z uporabo protokola, ki ga je določila Agencija za zdravstveno varstvo (HPA), Colindale, London.

2.5   Metode odkrivanja, identifikacije in določanja količine Campylobacterja spp.

2.5.1   Odkrivanje Campylobacterja spp.

Izolacijo in potrditev organizmov Campylobacter je treba opraviti, kakor je opisano v standardu ISO 10272-1:2006(E). Vsaj en izolat kampilobakterja na serijo mora biti speciiran z uporabo metod fenotipizacije, kakor je opisano v standardu ISO 10272-1:2006(E), ali objavljenimi molekularnimi metodami, kot so tehnike verižne reakcije s polimerazo (PCR). Navede se uporabljena metoda.

Za zagotovitev kakovosti se v referenčni laboratorij Skupnosti za kampilobakter v potrditev in speciacijo pošlje delež izolatov Campylobacterja spp. (največ 8).

Delež teh izolatov se vsako četrtletje pošlje v referenčni laboratorij Skupnosti.

Pri prevozu izolatov med laboratoriji je treba upoštevati ustrezne pogoje (npr. brisi oglja).

2.5.2   Določanje količine Campylobacterja spp.

Določanje količine Campylobacterja spp. se izvede v skladu s standardom ISO/TS 10272-2:2006 „Mikrobiologija živilskih in krmnih snovi – Horizontalna metoda za odkrivanje in štetje Campylobacterja spp. del 2: tehnika štetja kolonij“. 0,1 ml (od 10 ml) začetne suspenzije in nadaljnje razredčitve suspenzije se pregledajo, da se omogoči štetje do 106 cfu/g. 1 ml nerazredčene začetne suspenzije se pregleda, da se določi meja štetja 10 cfu/g. Vse meritve plošč se zabeležijo v dvojniku.

Da se zagotovi pravilna primerjava in ocena podatkov (za prihodnjo oceno tveganj), se za vsak laboratorij oceni merilna negotovost za metodo določanja količine.

Za oceno merilne negotovosti je treba uporabiti tehnično specifikacijo standarda ISO/TS 19036:2006, z izjemo, da se za oceno merilne negotovosti uporabi sočasno razredčitev začetne suspenzije.

Merilna negotovost je določena glede na intralaboratorijsko standardno deviacijo ponovljivosti. Podatki o oceni merilne negotovosti se zberejo od maja do septembra, da se zagotovijo pozitivni vzorci. Skupaj 12 pozitivnih vzorcev se oceni v podvojenih in sočasnih razredčitvah, ki se pripravijo iz 10 ml začetne suspenzije. Neobdelani podatki o oceni merilne negotovosti se sporočijo ločeno kot del celotnega opisa o izvajanju raziskave iz dela E.

3.   Skladiščenje izolatov

Da se omogoči npr. poznejše testiranje za protimikrobno odpornost, se priporoča skladiščenje reprezentativne podserije izolatov. Shrani se en izolat na pozitivni vzorec. Prednost se mora dati izolatu kampilobakterja, pridobljenemu med analizo določanja količine. Izolate je treba shraniti pri NRL z uporabo normalne metode NRL za zbiranje kultur, dokler ta zagotovlja obstoj sevov vsaj dve leti.

DEL E

Poročanje

Poročila morajo vsebovati vsaj naslednje podatke:

1.

Splošni opis izvajanja raziskave: — klavnice: njihovo celotno število na državo in število tistih, v katerih se je opravilo vzorčenje, — velikost primarnega vzorca, ki se je izvedla, — opis postopkov stratifikacije in naključnega izbora, — opis dejavnosti nadzora kakovosti, vključno s poročilom o 12 ocenah merilne negotovosti na laboratorij za določanje količine kampilobakterja, — končni rezultati.

2.

Posebne informacije v zvezi s podatki o razširjenosti Države članice predložijo rezultate raziskave v obliki neobdelanih podatkov, pri čemer uporabijo podatkovni slovar in obrazce za zbiranje podatkov, ki jih zagotovi Komisija. Podatki vsebujejo vsaj naslednje informacije: — ime/oznako klavnice, — identifikacijska številka klavne serije, — ime/oznako gospodarstva (farme) izvora klavne serije, — velikost gospodarstva, če je znana, — status cepljenja proti salmoneli pri jatah, če je znan, — starost pitovnih piščancev ob vzorčenju (zakolu), — podatke o tem, ali gre za prvo ali poznejšo serijo, ki se zakolje iz jate (pred delnim zakolom ali ne), — način reje (npr. konvecionalna, ekološka, prosta), — rezultati prejšnjih testiranj za salmonelo in kampilobakter v isti jati, — datum vzorčenja, — število piščancev, zaklanih v klavnicah na leto, — način uporabljene metode hlajenja (zrak, potopitev, sprej), — podatki o protokolu prevoza (kakor je določeno: D/N), — datum prejetja vzorca v laboratorij, — datum testiranja, — oznaka laboratorija, — vrsta vzorca, — opis uporabljenih metod za kulture, zlasti selektivnega(-ih) gojišča(-ih), — izolat kampilobakterja: metoda, uporabljena za speciacijo, — kampilobakter: rezultat bakteriološkega testiranja, vključno s speciacijo iz vzorca slepega črevesa, — kampilobakter: rezultat bakteriološkega testiranja, vključno s speciacijo in določanjem količine iz vzorca slepega črevesa, — salmonela: rezultat bakteriološkega testiranja in serotipizacije, — čas med vzorčenjem in analizo (na dvanajsturno obdobje).

3.

Posebne informacije v zvezi s testiranjem protimikrobne odpornosti izolatov kampilobakterja iz vzorcev slepega črevesa. Rezultati spremljanja protimikrobne odpornosti se bodo ocenili in poročali v skladu s členom 9 Direktive 2003/99/ES v letnem poročilu o trendih in virih zoonoz, njihovih povzročiteljih in protimikrobni odpornosti. Brez poseganja v določbe Priloge IV k Direktivi 2003/99/ES je treba predložiti naslednje informacije: — izvor izolatov, npr. temeljna raziskava, program nadzora, pasivno spremljanje, — število izolatov na vrsto kampilobakterja, testiranih na občutljivost, — število izolatov na vrsto kampilobakterja, ugotovljeno odpornih proti protimikrobnemu sredstvu, in — število popolnoma občutljivih izolatov na vrsto kampilobakterja in število izolatov na vrsto kampilobakterja, odpornih proti 1, 2, 3, 4 in > 4 protimikrobnih sredstev, navedenih v razpredelnici 1.

---

(1)  Ocena: število kmetijskih gospodarstev (4 v Estoniji, 5 v Latviji) × 2 jati na gospodarstvo × 2 klavni serija na jato × 6 krogov na leto. V Luksemburgu se zakoljejo le pitovni piščanci iz 3 malih jat. Klavna serija iz vsake jate bo vzorčena vsak trimester.

PRILOGA II

Najvišji finančni prispevek Skupnosti državam članicam

(EUR)
Država članica	Najvišji celotni znesek za sofinanciranje vzorčenja in analiz
Belgija – BE	58 092
Bolgarija – BG	58 092
Češka – CZ	58 092
Danska – DK	58 092
Nemčija – DE	58 092
Estonija – EE	14 688
Irska – IE	58 092
Grčija – EL	58 092
Španija – ES	58 092
Francija – FR	58 092
Italija – IT	58 092
Ciper – CY	58 092
Latvija – LV	18 360
Litva – LT	58 092
Luksemburg – LU	1 836
Madžarska – HU	58 092
Malta – MT	58 092
Nizozemska – NL	58 092
Avstrija – AT	58 092
Poljska – PL	58 092
Portugalska – PT	58 092
Romunija – RO	58 092
Slovenija – SI	58 092
Slovaška – SK	58 092
Finska – FI	58 092
Švedska – SE	58 092
Združeno kraljestvo – UK	58 092
Skupaj	1 429 092

PRILOGA III

Overjeno finančno poročilo o izvajanju raziskave o razširjenosti in protimikrobni odpornosti Campylobacterja spp. v jatah pitovnih piščancev in o razširjenosti Campylobacterja spp. in Salmonelle spp. v truplih pitovnih piščancev

Poročevalno obdobje od … do …

Izjava o stroških raziskave, ki so upravičeni do finančnega prispevka Skupnosti

Referenčna številka odločbe Komisije o finančnem prispevku Skupnosti:

…

…

Stroški, nastali v zvezi s/z	Število testov	Skupni stroški testiranja, nastali med poročevalnim obdobjem (nacionalna valuta)
bakteriološkim odkrivanjem Campylobacter spp.
bakteriološkim odkrivanjem Salmonella spp.
potrditvijo Campylobacter spp.
speciacijo izolatov kampilobakterja
štetjem izolatov kampilobakterja
serotipizacijo izolatov salmonele
testiranjem protimikrobne odpornosti izolatov kampilobakterja

Izjava upravičenca

Potrjujemo, da

—	so zgornji stroški resnični, so nastali med izvajanjem nalog po tej odločbi in so bili bistveni za ustrezno izvajanje navedenih nalog,

—	so vsa dokazila o stroških na voljo za revizijo,

—	za ta program ni bil zahtevan drug prispevek Skupnosti.

Datum: …

Finančno odgovorna oseba: …

Podpis: …