ПРИЛОЖЕНИЕ I

ТЕХНИЧЕСКИ СПЕЦИФИКАЦИИ, ОПРЕДЕЛЕНИ В ЧЛЕН 4

ЧАСТ A

Рамка за вземането на проби

За да се избегнат последиците, свързани с остаряването на пробите, мониторингът се провежда върху партиди на територията на кланицата.

Тъй като е доказано, че разпространението на Campylobacter spp. варира значително в зависимост от сезона, то подлежи на стратификация. За целта периодът от 12 месеца се разделя на 12 периода в рамките на всеки месец. Във всеки от тези периоди се взема 1/12 от общия размер на пробите.

Извън горните условия вземането на проби се осъществява на случаен принцип по отношение на избора на кланици, деня на вземане на проби в рамките на месеца и партидите, от които се вземат проби в избрания ден. По-специално, тази схема за случаен подбор ще гарантира съизмеримостта на избора на партиди за клане с броя на отглежданите птичи стада, в съответствие с различните типове производство (конвенционално, свободно — на открито, органично). В допълнение на това, случайният принцип не трябва да се нарушава от информацията за наличие на Salmonella spp. или Campylobacter spp. Компетентният орган поема отговорността за създаването на схемата за случаен избор и осигурява коректното ѝ прилагане. Пример за процедура за случаен подбор е превдиден в Доклада на работната група по мониторинг на събирането на информация за зоонозите при ЕОБХ относно предложените технически спецификации за програма за координиран мониторинг на Salmonella и Campylobacter в месото от бройлери в ЕС. Подробностите, свързани със схемата за случаен избор, се докладват на Комисията.

ЧАСТ Б

Размер на пробите

1.   Първоначален размер на пробите

а)	Първоначалният размер на пробите представлява броят на партидите в кланица, които ще бъдат изследвани.

б)	Вземат се проби от най-малко 384 партиди в кланица. Отчитайки възможността за отсъствие на реакция, следва да се вземат проби от около 10 % повече от посочените цифри.

в)	Като изключение от буква б) в Естония, Латвия и Люксембург трябва да се вземат проби от следния брой партиди в кланица (1): i) в Естония — най-малко 96 партиди в кланица; ii) в Латвия — най-малко 120 партиди в кланица; iii) в Люксембург — най-малко 12 партиди в кланица.

2.   Вторичен размер на пробите

Вторичният размер на пробите представлява броят на отделните пилета за кланица, от които ще се вземат проби. Този брой е 10 птици за откриване на Campylobacter в цекума и 1 птица за откриването на Campylobacter и Salmonella в птичи трупове. Пробите от цекумите и от птичите трупове трябва да бъдат от една и съща партида в кланица.

ЧАСТ В

Събиране на проби, обработка и анализ за откриване и изследване за антимикробна устойчивост на Campylobacter spp. при птичите стада от бройлери

1.   Събиране и транспортиране

Campylobacter са сравнително неустойчиви организми, които умират бързо извън вътрешностите на приемника. Ето защо пробите трябва да се вземат правилно и да се анализират бързо. Да се избягват крайните температури и транспортирането да се извършва възможно най-бързо.

Пробите трябва да се събират от цекуми с ненарушена цялост. Вземането да се извършва по време на изкормването.

Пробите се събират само от хора, обучени в стандартните процедури за вземане на проби. Целта е да се избегне външно замърсяване от съдържанието на цекума по време на вземането на проби. Това се постига най-добре чрез внимателно ръчно изтегляне при връзката с червата. Трябва да се взема един ненарушен цекум от птица и той трябва да е пълен (в противен случай не се взема под внимание). Препоръчително е да се вземат проби на случаен принцип в рамките на партидата (като се избягва първата част на партидата, подлежаща на клане), но не от последователни птици. Десетте събрани цекума могат да бъдат поставени в един стерилен плик за транспортиране.

Всяка съществена информация, получена от пробите, се попълва във формуляр, изготвен от компетентния орган, за да е възможно изпълнението на изискванията за докладване, посочени в част Д. На всяка проба и нейния формуляр се поставя етикет с уникален номер, който се използва от момента на вземането на пробата до момента на изследването. Компетентният орган трябва да създаде система за уникално номериране и начин на използването ѝ. Същият метод на идентифициране на партидата в кланицата се използва и за пробите от трупове.

Пробите от цекуми се транспортират до лабораторията във вид на цекуми с ненарушена цялост в рамките на 24 часа (например чрез изпращане по куриер) и там се анализират веднага. Когато това не е възможно, пробите трябва да се съхраняват в хладилник поне до момента на транспортирането и да се анализират до 72—80 часа след вземането им. В лабораторията пробите, които не могат да бъдат анализирани в същия ден, се съхраняват в хладилник до момента на анализа.

В лабораторията съдържанието на цекумите трябва да се отстрани стерилно и да се събере в една обща проба.

2.   Диагностичен метод

2.1.   Посявка

Директната посявка върху селективна хранителна среда дава добра оценка на разпространението на Campylobacter. Директната посявка на пробата се извършва върху селективна хранителна среда, подходяща за Campylobacter, (например модифициран Campylobacter, безкръвна селективна хранителна среда (CCDA); Karmali; или Preston Agar).

Плочките се инкубират при температура 41,5 ± 1 °C в микроаеробна атмосфера за поне 48 +/- 2 часа. Растежът може да се установи след 24 часа.

Микроаеробната атмосфера може да се постигне в разпространени в търговската мрежа микроаеробни инкубатори (газова смес 10 % CO2/6 % O2). При липсата на такива инкубатори могат да се използват микроаеробни системи за посявки като газови стъкленици. Съществуват и системи, които осигуряват необходимата микроаеробна атмосфера.

Трябва да се използват подходящи положителни и отрицателни контролни стойности за всяка партида от посявки.

2.2.   Потвърждение и определяне на вида на Genus Campylobacter

Изолирането и потвърждаването на Campylobacter организми трябва да се извършва по ISO 10272-1:2006(E). Поне на един изолат Campylobacter на партида трябва да се определи видът, като се използват фенотипни методи, описани от ISO 10272-1:2006(E) или публикувани молекулярни методи като техниките на полимеразната верижна реакция (PCR). Да се посочи използваният метод. Изолатите, на които е определен видът, не се използват в последващо изследване за антимикробна устойчивост.

Когато лабораторията не е достатъчно опитна в определянето на вида, изолатите се съхранят, както е указано в т. 2.4, и се организира допълнително обучение или се изпращат на по-опитна лаборатория след съгласуване с референтната лаборатория на Общността за Campylobacter.

2.3.   Контрол на качеството

За да се гарантира качеството, на референтната лаборатория на Общността за Campylobacter се изпраща извадка от максимум осем изолата на Campylobacter spp. за потвърждение и определяне на вида.

Извадката от тези изолати се изпраща на лабораторията или в една партида, или на три месеца. Ако се налага да се транспортират изолатите, се осигуряват подходящите условия (например използване на тампони с въглен).

2.4.   Съхранение

В НРЛ трябва да се съхранява най-малко един изолат за положителна проба, като се използва обичайният метод на НРЛ за събиране на изолати, при условие че той осигурява жизнеспособността на находките за минимум две години.

2.5.   Изследване за антимикробна устойчивост

Броят на изолатите на Campylobacter, които трябва да се включат в мониторинга на антимикробната устойчивост за всяка държава-членка, е 170. В мониторинга не трябва да се включва повече от един изолат за вид Campylobacter от една и съща партида в кланица.

Когато в дадена държава-членка броят на изолатите е по-малък от целевия размер на пробата, всички тези изолати се включват в мониторинга на антимикробната устойчивост.

Когато в дадена държава-членка броят на изолатите е по-голям от целевия размер на пробата, всички тези изолати или представителна извадка от случайно избрани изолати, с равен или по-голям брой от целевия размер, се включат в мониторинга.

Държавите-членки изследват поне антимикробните препарати, изброени в таблица 1, като използват дадените гранични стойности и подходяща концентрация, за да се определи податливостта на Campylobacter.

Таблица 1

	Антимикробен препарат	Гранична стойност (mg/l)R >
Campylobacter Jejuni	Еритромицин	4
	Ципрофлоксацин	1
	Тетрациклин	2
	Стрептомицин	2
	Гентамицин	1
Campylobacter Coli	Еритромицин	16
	Ципрофлоксацин	1
	Тетрациклин	2
	Стрептомицин	4
	Гентамицин	2

Методите за разреждане се извършват в съответствие с методите, описани в насоките на Института по клинични и лабораторни стандарти M31-A3 – трето издание „Стандарти за изпълнение за антимикробен диск и разтвори за тестовете за податливост при бактерии, изолирани от животни“ и M100 – S16 „Стандарти за извършване на изследване за податливост на антимикробни препарати“, шестнадесето международно допълнение.

ЧАСТ Г

Събиране на проби, обработка и анализ за откриване на Campylobacter spp. и Salmonella spp. в труповете на бройлери

1.   Събиране и транспортиране

За всяка партида в кланица трябва да се вземе цял труп веднага след охлаждане, но преди по-нататъшна обработка като замразяване, рязане или пакетиране. Това означава, че в някои кланици пробите се вземат след предохлаждането, където това е последната стъпка преди по-нататъшна обработка.

Взетата проба се поставя в отделен стерилен найлонов плик, като се избягва кръстосано замърсяване и се изпраща в лабораторията, където ще се извърши вземане на проба от кожата.

При събирането на труповете се избягва кръстосано замърсяване от други трупове или проби от цекуми. Ето защо на всички етапи трябва да се вземат предпазни мерки, за да е сигурно, че оборудването, използвано при вземането на пробите, транспортирането и съхранението, не е заразено с патогените, предмет на това проучване.

Всяка съществена информация, получена от пробите, се попълва във формуляр, изготвен от компетентния орган, за да се гарантира изпълнението на изискванията на част Д.

На всяка проба и нейния формуляр се поставя етикет с уникален номер, който се използва от момента на вземането на пробата до момента на изследването. Компетентният орган трябва да създаде система за уникално номериране и начин на използването ѝ. Същият метод за идентифициране на партидата в кланицата се използва и за пробите от цекуми.

Пробите се съхраняват при температура от + 2 до 8 °C и защитени от външно замърсяване по време на транспортирането.

В идеалния случай всички проби трябва да достигнат до лабораторията в рамките на 24 часа. При изключителни ситуации (дълго пътуване, национални празници или почивни дни) този период може да се удължи до 80 часа.

Когато се използват различни лаборатории за изследване на Campylobacter и Salmonella, лабораторията, изследваща Campylobacter, е с предимство при получаване на пробите.

2.   Вземане на проби в лабораторията и аналитични методи

2.1.   Получаване на проби

При получаване на пробите лабораториите проверяват информацията, записана от взелия пробите и попълват съответните части от формуляра на пробата.

Пробите се съхраняват при температура от + 2 до + 8 °C, като лабораторното им изследване започва възможно най-скоро след тяхното пристигане, но при всички случаи в рамките на 72 до 80 часа след вземането им.

2.2.   Подготовка на пробите

Целостта на опаковката след транспортирането на всички получени проби се проверяват преди изследване.

На всеки етап работещите с пробите трябва да избягват кръстосано замърсяване помежду им, както и замърсяване от околната среда.

Пилето трябва да се извади от плика, като се използват ръкавици и се внимава да не се замърси външната му повърхност.

Със стерилен инструмент и стерилна техника се отстранява кожата при шията, заедно с кожата от едната страна на тялото, като се избягват мазнините, за да се получи парче от 27 g, което се поставя в плик „Стомахер“ или пулсифайер.

2.3.   Начална суспензия

Парчето от 27 g за изследване се прехвърля в 9 обема (243 ml) буферна пептонна вода (БПВ), загрята до стайна температура. Сместа се обработва в плик „Стомахер“ или пулсифайер приблизително 1 минута (необходими са 27 g, за да се направи анализ едновременно за Salmonella spp. и Campylobacter spp. от една проба). Избягва се разпенването, като максимално се отстранява въздухът от плика „Стомахер“.

Началната суспензия се използва, както следва:

а)	10 ml (~ 1g) се поставят в 90 ml обогатител за откриване на Campylobacter spp.;

б)	10 ml (~ 1g) се поставят в празна стерилна епруветка; 1 ml се използва за изброяването на Campylobacter spp. върху плочки.

Останалата част от първоначалната суспензия (250 ml ~ 25g) се използва за откриването на Salmonella spp.

2.4.   Методи за откриване и идентифициране на Salmonella spp.

2.4.1.   Откриване на Salmonella spp.

Откриването на Salmonella spp. се извършва по ISO 6579-2002 (E). „Микробиология на храните и храните за животни — хоризонтален метод за откриване на Salmonella spp.“

2.4.2.   Определяне на серотипа на Salmonella spp.

НРЛ за Salmonella определя серотипа на поне един изолат от всяка положителна проба, използвайки схемата на Кауфман—Уайт.

За да се гарантира качеството, в референтната лаборатория на Общността за Salmonella се изпраща извадка от максимум 16 изолата, на които серотипът не може да се определи. Части от тези изолати се изпращат на три месеца.

2.4.3.   Определяне на фаготипа на Salmonella spp.

За S. Enteritidis и S. Typhimurium се препоръчва да се определи фаготипът на поне един изолат от всяка положителна проба, като се използва протоколът на Агенцията за защита на здравето (AЗЗ), Колиндейл, Лондон.

2.5.   Методи за откриване, идентифициране и количествено определяне на Campylobacter spp.

2.5.1.   Разпознаване на Campylobacter spp.

Изолирането и потвърждаването на организми Campylobacter се извършва, както е описано в ISO 10272-1:2006(E). Трябва да се определи видът на поне един изолат на Campylobacter за партида, като се използват фенотипните методи, описани в ISO 10272-1:2006(E) или публикувани молекулярни методи, като техниките на полимеразната верижна реакция (PCR). Използваният метод се посочва.

За да се гарантира качеството, извадка от максимум осем изолата на Campylobacter spp. се изпраща на референтната лаборатория на Общността за Campylobacter за потвърждение и определяне на вида.

Извадката от тези изолати се изпраща на лабораторията на всеки три месеца. Ако се налага изолатите да се транспортират между лабораториите, трябва да се осигурят подходящи условия (например използване на тампони с въглен).

2.5.2.   Количествено определяне на Campylobacter spp.

Количественото разпознаване на Campylobacter spp. се извършва според ISO/TS 10272-2:2006 „Микробиология на храните и храните за животни — хоризонтален метод за откриване и преброяване на Campylobacter spp. Част 2: Техника за преброяване на колониите“, като се започне от 10 ml начална суспензия, 0,1 ml от нея и по-нататъшни разреждания трябва да се изследват, за да може да се извърши преброяване до 106 cfu/g. В допълнение, 1 ml от неразредената начална суспензия се изследват, за да може да се получи граница от 10 cfu/g. Всички преброявания се правят в два екземпляра.

За да се направи точно сравнение и разбор на данните (за оценка на риска в бъдеще) за всяка лаборатория. се преценява неточността на измерването (НИ) при количествения детерминиращ метод.

За да се оцени НИ да се използва техническата спецификация ISO/TS 19036:2006, като се изключи това, че паралелните разреждания на началната суспензия се прилагат при оценката на НИ.

НИ се получава от вътрешнолабораторното стандартно отклонение на възпроизводимостта. Данните за НИ се събират от май до септември, за да се осигурят положителни проби. Общо 12 положителни проби се изследват в два екземпляра и се изготвят паралелни разреждания от 10 ml начална суспензия. Необработените данни за изчисляване на НИ се докладват отделно като част от цялостното описание за осъществяването на проучването, както е определено в част Д.

3.   Съхранение на изолатите

За да е възможно по-късно изследване за податливост на антимикробни препарати, се препоръчва съхранението на представителна група от изолати. Най-малко един изолат на Campylobacter за положителна проба (препоръчва се тя да е добита от количествен анализ) трябва да се съхранява в НРЛ, като се използва обичайният метод за събиране на изолати на НРЛ, при условие че той осигурява жизнеспособността на находките за минимум две години.

ЧАСТ Д

Доклади

Изготвят се доклади и те съдържат поне следната информация:

1.

Общо описание на извършване на проучването: — кланици: общият им брой в държавата и броят на тези, от които са взети проби; — реализиран първоначален размер на пробите; — описание на процедурите за стратификацията и прилагането на процедурите на случайния избор; — описанието на дейностите, свързани с контрола на качеството, включващо и доклад за 12 оценки на НИ за лаборатория относно количествено определяне на Campylobacter; — общи резултати.

2.

Специфична информация по отношение на данните за разпространение. Държавите-членки представят резултатите от проучването под формата на необработени данни, като използват речник за данни и формуляри за събиране на данни, предоставени от Комисията. Тези данни включват следната информация: — име/код на кланицата; — идентификационен номер на партидата в кланицата; — име/код на холдинга, част от който е кланицата; — големина на холдинга, ако е известно; — състояние на имунизациите срещу Salmonella, ако е известно; — възраст на бройлерите при вземане на пробите (клането); — информация дали това е първата или поредна партида, която се коли от птичето стадо (предшестващо прореждането или не); — тип производство (конвенционално, свободно — на открито, органично); — резултати от предишни изследвания за Salmonella и Campylobacter в същото птиче стадо; — дата на вземане на пробите; — брой птици, които се колят годишно в дадената кланица; — метод за охлаждане, който се използва (въздушен, потапяне, пръскане); — детайли от транспортния протокол (както е уточнено: Да/Не); — дата на получаване в лабораторията; — дата на изследване; — идентификация на лабораторията; — вид проба; — описание на използваните методи за посявка и в частност — селективната хранителна среда/и; — Campylobacter изолати: метод, използван при определяне на вида; — Campylobacter: резултат от бактериологичното изследване, включително и определяне на вида от пробата от цекума; — Campylobacter: резултат от бактериологичното изследване, включително и определяне на вида от пробата от тялото; — Salmonella: резултат от бактериологичното изследване и определянето на серотипа; — време между вземане на пробата и анализа (за 12-часов период).

3.

Специфична информация във връзка с изследването на антимикробната устойчивост на изолатите на Campylobacter от проби на цекум. Резултатите от мониторинга на антимикробната устойчивост се оценяват и докладват в съответствие с член 9 от Директива 2003/99/ЕО в годишния доклад за процесите и източниците на зоонози, заразни агенти, причиняващи зоонози и антимикробната устойчивост. Без да се нарушават клаузите на приложение IV към Директива 2003/99/ЕО, се докладва следната информация: — произход на изолатите — базово проучване, програма за контрол, пасивно наблюдение; — брой на изолатите, изследвани за податливост за видове Campylobacter; — брой на изолатите, определени като устойчиви на антимикробен препарат за видове Campylobacter; и — брой на напълно податливи изолати и брой на изолати, устойчиви на 1, 2, 3, 4, и > 4 антимикробни препарата, изброени в таблица 1 за видове Campylobacter.

---

(1)  Изчисление: брой холдинги (4 в Естония, 5 в Латвия) по две птичи стада на холдинг, по две партиди в кланица на птиче стадо, шест пъти в годината. В Люксембург се колят бройлери от три малки птичи стада. Да се взема проба от партида в кланица на всеки три месеца.

ПРИЛОЖЕНИЕ II

Максимален размер на финансовата помощ за държавите-членки

(в EUR)
Държава-членка	Максимална обща сума за съфинансиране на вземането на проби и анализ
Белгия — BE	58 092
България — BG	58 092
Чешка република — CZ	58 092
Дания — DK	58 092
Германия — DE	58 092
Естония — EE	14 688
Ирландия — IE	58 092
Гърция — EL	58 092
Испания — ES	58 092
Франция — FR	58 092
Италия — IT	58 092
Кипър — CY	58 092
Латвия — LV	18 360
Литва — LT	58 092
Люксембург — LU	1 836
Унгария — HU	58 092
Малта — MT	58 092
Нидерландия — NL	58 092
Австрия — AT	58 092
Полша — PL	58 092
Португалия — PT	58 092
Румъния — RO	58 092
Словения — SI	58 092
Словакия – SK	58 092
Финландия — FI	58 092
Швеция — SE	58 092
Великобритания — UK	58 092
Общо	1 429 092

ПРИЛОЖЕНИЕ III

Заверен финансов отчет за провеждането на проучване за разпространението и антимикробната устойчивост на Campylobacter spp. в птичите стада от бройлери и разпространението и антимикробната устойчивост на Campylobacter spp. и Salmonella spp. в труповете на бройлери

Отчетен период: … до …

Отчет за разходите по извършване на проучването, подлежащи на финансова помощ от Общността:

Референтен номер на решението на Комисията, предвиждащо финансовата помощ:

…

…

Извършени разходи, свързани с функции по	Брой на тестовете	Общ размер на разходите, извършени по време на изследванията през отчетния период (в национална валута)
Бактериологични изследвания за Campylobacter spp.
Бактериологични изследвания за Salmonella spp.
Потвърждение на Campylobacter spp.
Определяне на вида на изолатите от Campylobacter
Преброяване на изолатите от Campylobacter
Определяне на серотипа на изолатите от Salmonella
Изследване на антимикробната устойчивост на изолатите от Campylobacter

Декларация от бенефициера

С настоящото удостоверяваме, че

—	горепосочените разходи са достоверни и са извършени при изпълнението на задачите, определени в настоящото решение и бяха от съществено значение за правилното осъществяване на тези задачи;

—	всички документи за разходите са на разположение за целите на одита;

—	не е изисквана друга финансова помощ от Общността по тази програма.

Дата: …

Финансово отговорно лице: …

Подпис: …