ALLEGATO I

SPECIFICHE TECNICHE DI CUI ALL’ARTICOLO 4

PARTE A

Base di campionamento

Per evitare distorsioni connesse all’età, la sorveglianza avverrà per lotti di macellazione al macello.

Poiché è dimostrato che la diffusione del campylobacter spp. varia significativamente a seconda della stagione, occorre effettuare una stratificazione. A tal fine, un periodo di 12 mesi va suddiviso in 12 periodi di un 1 mese. In ciascuno di essi, va prelevato 1/12 del campione totale.

Altrimenti, il campionamento deve basarsi su una selezione casuale, sia per ciò che riguarda i macelli, che per i giorni di campionamento ogni mese, che per i lotti da prelevare in un determinato giorno di campionamento. In particolare, il piano di randomizzazione deve garantire una scelta di lotti di macellazione proporzionati al numero di branchi ingrassati a seconda dei vari tipi di produzione (convenzionale, all’aperto, ecologica). Lo statuto della salmonella spp. o del campylobacter spp., se noto all’atto della macellazione, non deve, inoltre, influenzare la randomizzazione. L’autorità competente genererà il piano di randomizzazione e garantirà la sua corretta attuazione. Un esempio di tale piano si trova nella relazione della task force dell’EFSA che raccoglie i dati sulla sorveglianza delle zoonosi, riguardo alle specifiche tecniche proposte per un programma di sorveglianza coordinato sulla salmonella e il campylobacter nella carne di pollo nell’UE. I dettagli del procedimento di randomizzazione vanno comunicati alla Commissione.

PARTE B

Dimensione del campione

1.   Dimensione del campione elementare

a)	La dimensione del campione elementare dà il numero di lotti di macellazione da provare.

b)	Vanno prelevati almeno 384 lotti di macellazione. In previsione di mancate risposte, si preleva il 10 % in più circa delle cifre indicate.

c)	In deroga al punto b), in Estonia, Lettonia e Lussemburgo va prelevato il seguente numero di lotti di macellazione (1): i) in Estonia, almeno 96 lotti di macellazione; ii) in Lettonia, almeno 120 lotti di macellazione; iii) in Lussemburgo, almeno 12 lotti di macellazione.

2.   Dimensione del campione secondario

La dimensione del campione secondario dà il numero dei singoli polli da carne da campionare per lotto di macellazione. Esso sarà di 10 volatili per individuare il campylobacter negli intestini ciechi e di 1 volatile per individuare il campylobacter e la salmonella nelle carcasse. I campioni degli intestini ciechi e il campione della carcassa devono provenire dallo stesso lotto di macellazione.

PARTE C

Raccolta, trattamento e analisi dei campioni per individuare il campylobacter spp nei branchi di polli da ingrasso e provare la sua resistenza antimicrobica

1.   Raccolta e trasporto

I campylobacter sono organismi relativamente fragili, che muoiono rapidamente all’esterno dell’intestino ospite. I campioni vanno perciò prelevati con la dovuta attenzione e analizzati rapidamente. Evitare temperature estreme; effettuare eventuali spostamenti nel modo più veloce possibile.

I campioni da prelevare devono essere intestini ciechi intatti. I campioni di intestino cieco saranno prelevati al momento dell’eviscerazione.

La raccolta dei campioni va affidata esclusivamente a personale addestrato alle procedure standard di campionamento. L’obiettivo principale è ridurre al minimo la contaminazione esterna del contenuto ciecale durante il prelievo. Il modo migliore per ottenerlo è un’accurata trazione manuale alla giunzione con l’intestino. Si prende un intestino cieco intatto per volatile; i campionatori verificano che l’intestino cieco sia pieno; in caso contrario non verrà preso in considerazione. I volatili vanno possibilmente prelevati a caso in tutto il lotto (evitando la prima parte del lotto da macellare); effettuare un campionamento in ordine sparso. I 10 intestini ciechi raccolti possono essere messi in un’unica borsa/imballaggio sterili per il trasporto.

Ogni utile informazione sul campione sarà annotata su un modulo di campionamento fornito dall’autorità competente per soddisfare i requisiti di notifica di cui alla parte E. Ogni campione, e il relativo modulo, va etichettato con un unico numero da usare dal campionamento alle prove. L’autorità competente organizzerà l’elaborazione e l’uso del sistema di numerazione unica. Lo stesso numero di identificazione del lotto di macellazione sarà usato per il campione delle carcasse.

Entro 24 ore, si trasporteranno i campioni di intestino cieco al laboratorio, dove saranno analizzati immediatamente, come intestini ciechi intatti (trasporto notturno o corriere). In caso di impedimento, i campioni vanno tenuti refrigerati almeno fino al trasporto al laboratorio; l’analisi deve avvenire entro 72-80 ore dopo il campionamento. Al laboratorio, i campioni che non possono essere provati il giorno di arrivo vanno tenuti refrigerati fino all’analisi.

In laboratorio, il contenuto ciecale va rimosso in condizioni asettiche e riunito in un campione composito.

2.   Metodo diagnostico

2.1.   Coltura

La coltura diretta in ambiente selettivo fornisce una buona stima della diffusione dei campylobacter. La coltura diretta del campione va effettuata in un ambiente selettivo adatto al campylobacter [ambiente selettivo modificato per campylobacter, esente da sangue (CCDA); Karmali; o Preston agar].

Le piastre vanno incubate a 41,5 ± 1 °C, in atmosfera microaerobica, per almeno 48 ± 2 ore. Una crescita può essere accertata dopo 24 ore.

L’atmosfera microaerobica può essere ottenuta in incubatrici microaerobiche normalmente in commercio (miscela di gas 10 % CO2/6 % O2). In mancanza di tali incubatrici, si possono usare sistemi di coltura microaerobici come i contenitori di gas. Esistono in commercio sistemi d’imballaggio sotto gas che forniscono un’atmosfera microaerobica adeguata.

Per ogni lotto di campioni messo a coltura, vanno previsti adeguati controlli positivi e negativi.

2.2.   Conferma e speciazione del genere campylobacter

L’isolamento e la conferma di organismi di campylobacter devono avvenire secondo la norma ISO 10272-1:2006(E). Effettuare la speciazione di almeno un isolato di campylobacter per lotto usando metodi fenotipici secondo la norma ISO 10272-1:2006(E) o metodi molecolari come le tecniche di reazione a catena della polimerasi (PCR). Indicare i metodi usati. Utilizzare l’isolato speciato per la successiva prova di resistenza antimicrobica.

Se un laboratorio non ha molta esperienza nel campo della speciazione, conserva l’isolato come descritto al punto 2.4 per il tempo necessario a un’adeguata formazione o lo invia a un laboratorio con maggior esperienza, dopo aver consultato il laboratorio comunitario di riferimento per il campylobacter.

2.3.   Controllo di qualità

A garanzia della qualità, occorre inviare al laboratorio comunitario di riferimento per il campylobacter, a fini di conferma e speciazione, una parte degli isolati di campylobacter spp. (non più di 8).

Una parte di tali isolati va inviata al laboratorio in un unico lotto o trimestralmente. L’eventuale trasporto degli isolati da un laboratorio all’altro va effettuato in modo appropriato (per esempio in tamponi di carbone).

2.4.   Conservazione

Se è garantita la sopravvivenza dei ceppi per almeno 2 anni, si conserva almeno un isolato per campione positivo presso i LNR, con il normale metodo di raccolta delle colture degli LNR.

2.5.   Prove della resistenza antimicrobica

Nella sorveglianza della resistenza antimicrobica, vanno inclusi 170 isolati di campylobacter per Stato membro. Nella sorveglianza non va incluso più di 1 isolato per specie di campylobacter proveniente dallo stesso lotto di macellazione.

Negli Stati membri in cui, in un determinato anno, è disponibile un numero di isolati inferiore alla dimensione prescritta del campione, tali isolati vanno tutti inclusi nella sorveglianza della resistenza antimicrobica.

Negli Stati membri in cui è disponibile un numero di isolati superiore, vanno inclusi tutti gli isolati oppure un campione rappresentativo casuale di dimensione pari o maggiore a quella prescritta del campione.

Gli Stati membri proveranno almeno gli antimicrobici di cui alla tabella 1, usando i valori limite dati e un'adeguata gamma di concentrazioni per determinare la sensibilità del campylobacter.

Tabella 1

	Antimicrobico	Valore limite (mg/l) R >
Campylobacter jejuni	Eritromicina	4
	Ciprofloxacina	1
	Tetraciclina	2
	Streptomicina	2
	Gentamicina	1
Campylobacter coli	Eritromicina	16
	Ciprofloxacina	1
	Tetraciclina	2
	Streptomicina	4
	gentamicina	2

Le diluizioni avverranno con i metodi di cui agli orientamenti M31-A3, Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated from Animals (Third Edition) e M100-S16, Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility testing (Sixteenth International Supplement), del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute).

PARTE D

Raccolta, trattamento e analisi dei campioni per individuare il campylobacter spp. e la salmonella spp. nelle carcasse di polli da ingrasso

1.   Raccolta e trasporto

Immediatamente dopo la refrigerazione ma prima di ulteriori trasformazioni (come congelamento, taglio o imballaggio), si preleva un’intera carcassa per lotto di macellazione I campioni sono prelevati dopo il pre-raffreddamento nei macelli in cui questa fase è l’ultima prima di ulteriori trasformazioni.

Il campione prelevato, messo in un sacchetto separato di plastica sterile per evitare contaminazioni trasversali, è inviato al laboratorio che effettua il campionamento della pelle.

Durante la raccolta delle carcasse, va evitata la contaminazione trasversale da altre carcasse o da altri campioni di intestini ciechi. Bisogna perciò sempre prendere ogni precauzione per escludere che l’attrezzatura usata per il campionamento, il trasporto e la conservazione non sia contaminata con gli agenti patogeni studiati nell’indagine.

Ogni utile informazione sul campione va annotata su un modulo di campionamento fornito dall’autorità competente per soddisfare i requisiti di registrazione di cui alla parte E.

Ogni campione, e il relativo modulo, va etichettato con un unico numero da usare dal campionamento alle prove. L’autorità competente organizzerà l’elaborazione e l’uso del sistema di numerazione unica. Lo stesso numero di identificazione del lotto di macellazione sarà usato per i campioni di intestino cieco.

Durante eventuali trasporti, i campioni vanno tenuti a una temperatura tra 2 e 8 °C ed esenti da contaminazione esterna.

Sarebbe bene che tutti i campioni raggiungessero il laboratorio entro 24 ore dal campionamento. In situazioni eccezionali (viaggi lunghi, fine settimana, feste nazionali), tale periodo può essere portato a 80 ore.

Se si usano più laboratori per le prove sul campylobacter e sulla salmonella, quello che prova il campylobacter avrà la precedenza per il ricevimento del campione.

2.   Campionamento in laboratorio e metodi d’analisi

2.1.   Ricevimento dei campioni

Al ricevimento dei campioni, i laboratori controllano le informazioni registrate dal campionatore e completano le pertinenti sezioni del modulo di campionamento.

In laboratorio, i campioni vanno tenuti a una temperatura di + 2-8 °C e la procedura di campionamento comincerà appena possibile dopo l’arrivo dei campioni al laboratorio e comunque entro 72/80 ore dall’atto del campionamento.

2.2.   Preparazione del campione

Prima delle prove, si accerta l’integrità dell’imballaggio di trasporto esaminando tutti i campioni ricevuti.

In tutte le fasi, gli operatori eviteranno contaminazioni trasversali tra campioni e dall’ambiente circostante.

Indossando guanti monouso, essi rimuoveranno il pollo dalla scatola del campione, stando attenti a non contaminare la superficie esterna del volatile.

Servendosi di strumenti sterili e in condizioni asettiche, si toglie la pelle del collo, se presente, insieme a quella di un lato della carcassa, senza grasso, per comporre una porzione di prova di 27 g, ponendola in un sacchetto per stomacher (o nel pulsifier).

2.3.   Sospensione iniziale

La porzione di prova da 27 g viene aggiunta a 9 volumi d’acqua (243 ml) con tampone di peptone (Buffered Peptone Water — BPW) portata in precedenza a temperatura ambiente. La miscela va trattata in uno stomacher o in un pulsifier per circa 1 minuto (sono necessari 27 g per l’analisi parallela di salmonella spp. e campylobacter spp. da uno stesso campione). Evitare la formazione di schiuma sottraendo allo stomacher tutta l’aria possibile.

La sospensione iniziale sarà utilizzata nel modo che segue:

a)	per individuare il campylobacter spp. si aggiungono 10 ml (~1g) a 90 ml del mezzo d’arricchimento;

b)	si aggiungono 10 ml (~1g) a una pipetta sterile vuota; 1 ml si usa per conteggiare il campylobacter spp. su piastre selettive.

Il resto della sospensione iniziale (250 ml, ~25g) si usa per individuare la salmonella spp.

2.4.   Metodi di individuazione e d’identificazione della salmonella spp.

2.4.1.   Individuazione della salmonella spp.

La salmonella spp. viene individuata in base alla norma ISO 6579-2002 (E). «Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for the detection of salmonella spp.»

2.4.2.   Sierotipizzazione della salmonella spp.

Usando lo schema Kaufmann-White, il LNR per la salmonella tipizzerà almeno un isolato per ogni campione positivo.

A garanzia della qualità, una parte di isolati non tipizzabili (16 al massimo) va inviata all’LCR per la salmonella. Una parte di tali isolati sarà inviata a tale laboratorio con scadenza trimestrale.

2.4.3.   Fagotipizzazione della salmonella spp.

Per la S. Enteritidis e la S. Typhimurium, si raccomanda che almeno un isolato di ogni campione positivo sia fagotipizzato, usando il protocollo definito dall’Agenzia per la tutela della salute (HPA), Colindale, Londra.

2.5.   Metodi d’individuazione, d’identificazione e di quantificazione del campylobacter spp.

2.5.1.   Individuazione del campylobacter spp.

L’isolamento e la conferma di organismi di campylobacter devono avvenire secondo la norma ISO 10272-1:2006 (E). Effettuare la speciazione di almeno un isolato di campylobacter per lotto usando metodi fenotipici secondo la norma ISO 10272-1:2006 (E) o metodi molecolari come le tecniche di reazione a catena della polimerasi (PCR). Indicare i metodi usati.

A garanzia della qualità, occorre inviare all’LCR per il campylobacter, a fini di conferma e speciazione, una parte degli isolati di campylobacter spp. (non più di 8).

Una parte degli isolati va inviata a tale laboratorio con scadenza trimestrale. L’eventuale trasporto degli isolati da un laboratorio all’altro va effettuato in modo appropriato (per esempio in tamponi di carbone).

2.5.2.   Quantificazione del campylobacter spp.

L’individuazione quantitativa del campylobacter spp. deve avvenire secondo la norma ISO/TS 10272-2:2006 «Microbiology of food and animal feeding stuffs — Horizontal method for detection and enumeration of campylobacter spp. Part 2: Colony-count technique». A partire da 10 ml di sospensione iniziale, si esamina 0,1 ml di tale sospensione e delle sue ulteriori diluizioni per permettere di conteggiare fino a 106 CFU/g. Si esamina inoltre 1 ml di sospensione iniziale non diluita per ottenere un limite di conteggio di 10 CFU/g. Tutti i conteggi su piastre sono fatti 2 volte.

Per permettere una comparazione e un giudizio corretti sui dati (per future valutazioni di rischio), per ogni laboratorio si stima l’incertezza di misurazione (IM) del metodo di individuazione quantitativa.

Per stimare l’IM, si ricorre alla specifica tecnica ISO/TS 19036:2006 quando, per tale stima, non si usano le diluizioni parallele della sospensione iniziale.

La IM è derivata dalla deviazione standard, interna al laboratorio, della riproducibilità. I dati sulla stima dell’IM vanno raccolti da maggio a settembre per garantire campioni positivi. Si esamineranno, 2 volte, 12 campioni positivi in tutto e si prepareranno diluizioni parallele a partire dalla sospensione iniziale di 10 ml. I dati originali sulla stima dell’IM vanno comunicati separatamente come parte della descrizione complessiva sull’indagine eseguita, come precisato nella parte E.

3.   Stoccaggio degli isolati

Si raccomanda di conservare un sottoinsieme rappresentativo di isolati al fine, per esempio, di provarne in un secondo tempo la sensibilità antimicrobica. Va conservato un isolato per campione positivo. È preferibile conservare l’isolato di campylobacter ottenuto dall’analisi quantitativa. Se è garantita la sopravvivenza dei ceppi per almeno 2 anni, gli isolati vanno conservati presso gli LNR, con il normale metodo di raccolta delle colture dell’LNR.

PARTE E

Relazioni

Le relazioni devono contenere almeno le seguenti informazioni:

1)

Descrizione complessiva dell’attuazione dell’indagine: — macelli: numero totale per paese e numero di quelli sottoposti a campionamento, — dimensione del campione elementare realizzato, — descrizione delle procedure di stratificazione e randomizzazione, — descrizione delle attività di controllo della qualità che comprenda una relazione sulle 12 stime dell’IM effettuate per laboratorio in relazione alla quantificazione del campylobacter, — risultati complessivi;

2)

Informazioni specifiche riguardo ai dati sulla diffusione Gli Stati membri presentano i risultati della ricerca in forma di dati grezzi usando un dizionario dei dati e i formulari per la loro raccolta, forniti dalla Commissione. Tali dati comprenderanno almeno le seguenti informazioni: — nome/codice del macello, — numero di identificazione del lotto di macellazione, — nome/codice dell’azienda agricola d’origine del lotto di macellazione, — dimensione dell’azienda, se nota, — stato di vaccinazione del branco contro la salmonella, se noto, — età dei polli da ingrasso all’atto del campionamento (macello), — indicazione se il lotto di macellazione di un determinato branco fosse il primo o uno successivo (precedente o no l’assottigliamento), — tipo di produzione (convenzionale, all’aperto, ecologica), — risultati di prove precedenti sulla salmonella e il campylobacter nello stesso branco, — data del campionamento, — numero di volatili macellati all’anno in tale macello, — metodo di refrigerazione impiegato (aria, immersione, spray), — particolari del protocollo di trasporto (come precisato: S/N), — data di ricevimento da parte del laboratorio, — data del test, — identificazione del laboratorio, — tipo di campione, — descrizione dei metodi di coltura usati, in particolare del/degli ambienti selettivi, — isolati di campylobacter: metodo di speciazione, — campylobacter: risultato della prova batteriologica, compresa la speciazione a partire dal campione ciecale, — campylobacter: risultato della prova batteriologica, compresa la speciazione e la quantificazione a partire dal campione di carcasse, — salmonella: risultato della prova batteriologica e della sierotipizzazione, — lasso di tempo tra campionamento e analisi (periodi di 12 ore);

3)

Informazioni specifiche riguardo alla prova di resistenza agli antimicrobici degli isolati di campylobacter di campioni provenienti dall’intestino cieco. Conformemente all’articolo 9 della direttiva 2003/99/CE, i risultati sulla sorveglianza della resistenza agli antimicrobici vanno valutati e trasmessi nella relazione annuale sulle tendenze e le fonti delle zoonosi, degli agenti zoonotici e della resistenza agli antimicrobici. Fatte salve le disposizioni dell’allegato IV della direttiva 2003/99/CE, vanno comunicate le seguenti informazioni: — origine degli isolati, cioè studio di riferimento, programma di controllo, sorveglianza passiva, — numero di isolati per specie di campylobacter sottoposti alla prova di sensibilità, — numero di isolati risultati resistenti, per antimicrobico e per specie di campylobacter, nonché — numero di isolati totalmente sensibili e numero di isolati resistenti agli antimicrobici 1, 2, 3, 4 e > 4 di cui alla tabella 1, per specie di campylobacter.

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(1)  Stima: numero di aziende (4 in Estonia, 5 in Lettonia) × 2 branchi per azienda × 2 lotti di macellazione per branco × 6 cicli all’anno. In Lussemburgo, vengono macellati solo polli da ingrasso di 3 piccoli branchi. Si preleva 1 lotto di macellazione da ciascuno di essi ogni trimestre.

ALLEGATO II

Contributo finanziario massimo della Comunità agli Stati membri

(EUR)
Stato membro	Importo totale massimo per il cofinanziamento del campionamento e delle analisi
Belgio — BE	58 092
Bulgaria — BG	58 092
Repubblica ceca — CZ	58 092
Danimarca — DK	58 092
Germania — DE	58 092
Estonia — EE	14 688
Irlanda — IE	58 092
Grecia — EL	58 092
Spagna — ES	58 092
Francia — FR	58 092
Italia — IT	58 092
Cipro — CY	58 092
Lettonia — LV	18 360
Lituania — LT	58 092
Lussemburgo — LU	1 836
Ungheria — HU	58 092
Malta — MT	58 092
Paesi Bassi — NL	58 092
Austria — AT	58 092
Polonia — PL	58 092
Portogallo — PT	58 092
Romania — RO	58 092
Slovenia — SI	58 092
Slovacchia — SK	58 092
Finlandia — FI	58 092
Svezia — SE	58 092
Regno Unito — UK	58 092
Totale	1 429 092

ALLEGATO III

Relazione finanziaria certificata sull’attuazione di un'indagine relativa alla diffusione e alla resistenza agli antimicrobici del campylobacter spp. nei branchi di polli da ingrasso e alla diffusione del campylobacter spp. e della salmonella spp. nelle carcasse di pollo

Periodo di riferimento: dal … al …

Dichiarazione relativa alle spese sostenute per l’indagine e ammissibili al contributo finanziario della Comunità

Numero di riferimento della decisione della Commissione relativa al contributo finanziario della Comunità:

…

…

Spese sostenute in rapporto a:	Numero di prove	Totale delle spese sostenute per le prove durante il periodo di riferimento (valuta nazionale)
individuazione batteriologica del campylobacter spp.
individuazione batteriologica della salmonella spp.
conferma del campylobacter spp.
speciazione degli isolati di campylobacter
conteggio degli isolati di campylobacter
sierotipizzazione degli isolati di salmonella
prove di resistenza agli antimicrobici degli isolati di campylobacter

Dichiarazione del beneficiario

Si dichiara che:

—	le spese di cui sopra sono state effettivamente sostenute per espletare i compiti previsti dalla presente decisione ed erano indispensabili alla corretta esecuzione di tali compiti,

—	l’intera documentazione che le giustifica è a disposizione per le verifiche contabili,

—	non è stato richiesto alcun altro contributo comunitario per questo programma.

Data: …

Responsabile finanziario: …

Firma: …