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Document 31967L0427
Council Directive 67/427/EEC of 27 June 1967 on the use of certain preservatives for the surface treatment of citrus fruit and on the control measures to be used for the qualitative and quantitative analysis of preservatives in and on citrus fruit
Directiva 67/427/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa à utilização de certos conservantes no tratamento de superfície dos citrinos e às medidas de controlo para a pesquisa e doseamento dos conservantes nos citrinos
Directiva 67/427/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa à utilização de certos conservantes no tratamento de superfície dos citrinos e às medidas de controlo para a pesquisa e doseamento dos conservantes nos citrinos
JO 148 de 11.7.1967, p. 1–9
(DE, FR, IT, NL) Outras edições especiais
(DA, EL, ES, PT, FI, SV)
Edição especial inglesa: Série I Fascículo 1967 p. 169 - 177
No longer in force, Date of end of validity: 28/01/2004; revogado por 32003L0114
Directiva 67/427/CEE do Conselho, de 27 de Junho de 1967, relativa à utilização de certos conservantes no tratamento de superfície dos citrinos e às medidas de controlo para a pesquisa e doseamento dos conservantes nos citrinos
Jornal Oficial nº 148 de 11/07/1967 p. 0001 - 0009
Edição especial finlandesa: Capítulo 13 Fascículo 1 p. 0090
Edição especial dinamarquesa: Série I Capítulo 1967 p. 0154
Edição especial sueca: Capítulo 13 Fascículo 1 p. 0090
Edição especial inglesa: Série I Capítulo 1967 p. 0169 - 0177
Edição especial grega: Capítulo 03 Fascículo 2 p. 0120
Edição especial espanhola: Capítulo 13 Fascículo 1 p. 0039
Edição especial portuguesa: Capítulo 13 Fascículo 1 p. 0039
DIRECTIVA DO CONSELHO de 27 de Junho de 1967 relativa à utilização de certos conservantes no tratamento de superficie dos citrinos e às medidas de controlo para a pesquisa e doseamento dos conservantes nos citrinos ( 67/427/CEE ) O CONSELHO DA COMUNIDADE ECONOMICA EUROPEIA , Tendo em conta o Tratado que institui a Comunidade Económica Europeia e , nomeadamente , o seu artigo 100 º , Tendo em conta a proposta da Comissão , Tendo em conta o parecer do Parlamento Europeu (1) , Tendo em conta o parecer do Comité Económico e Social (2) , Considerando que , nos termos do artigo 5 º da Directiva do Conselho , de 5 de Novembro de 1963 , relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes aos conservantes que podem ser utilizados nos géneros destinados à alimentação humana (3) , com a última redacção que lhe foi dada pelo artigo 1 º da Directiva do Conselho , de 14 de Dezembro de 1966 (4) , os Estados-membros podem manter até 30 de Junho de 1967 as disposições das legislações nacionais relativas ao tratamento de superfície dos citrinos com bifenilo , ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio ; Considerando que a utilização destas substâncias no tratamento de superfície dos citrinos não constitui perigo para a saúde se a dose residual expressa em ortofenilfenol por quilograma de frutos inteiros não exceder 70 miligramas de bifenilo e 12 miligramas de ortofenilfenol de sódio ; Considerando , por outro lado , que é conveniente indicar de maneira adequada o tratameto efectuado em todas as fases de comercialização ; Considerando que a autorização a nível comunitário das três substâncias consideradas pressupõe a fixação de regras comuns para o controlo oficial dos citrinos tratados ; Considerando que a aplicação pelos Estados-membros das disposições da presente directiva só pode ser realizada após um período de transição ; que é , portanto , conveniente manter até ao fim deste período as disposições das legislações nacionais relativas ao tratamento de superficie dos citrinos pelos três conservantes considerados ; Considerando que não é conveniente impor a um Estados-membro a obrigação de autorizar a utilização de um conservante nos géneros alimentícios produzidos e consumidos no seu próprio território quando não há necessidade teconológica que justifique esta utilização , ADOPTOU A PRESENTE DIRECTIVA : Artigo 1 º A Directiva do Conselho , de 5 Novembro de 1963 , relativa à aproximação das legislações dos Estados-membros respeitantes aos conservantes que podem ser utilizados nos géneros destinados à alimentação humana é alterada do seguinte modo : 1 . No n º 2 do artigo 2 º , a segunda frase passa a ter a seguinte redacção : « Contudo , a legislação de um Estado-membro só pode excluir totalmente a utilização de um dos conservantes enumerados no Anexo no caso em que não exista uma necessidade tecnológica de utilização do conservante nos géneros alimentícios produzidos e consumidos no seu próprio território » . 2 . São adicionados os conservantes seguintes aos enumerados na Secção I do Anexo : N º CEE * Designação * Condições de utilização * E 230 * Bifenilo ( Difenilo ) * a ) Exclusivamente para o tratamento de superfície de citrinos * * * b ) No momento da colocação no mercado dos citrinos : * * * i ) O teor residual por kg de citrinos ( frutos inteiros ) não deve exceder : * * * Para o bifenilo : 70 mg ; para o ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio , isoladamente ou em conjunto , expressos em ortofenilfenol : 12 mg * * * ii ) O tratamento deve ser indicado : * * * - no comércio por grosso , nas facturas e numa das superfícies exteriores das embalagens , pela menção : « Conservado por meio de ... » seguido do nome da ou das substâncias utilizadas * * * - no comércio a retalho , por uma indicação visível que assegure de maneira inequívoca a informação do consumidor * E 231 * Ortofenilfenol * a ) Exclusivamente para o tratamento de superfície de citrinos * * * b ) No momento da colocação no mercado dos citrinos : * * * i ) O teor residual por kg de citrinos ( frutos inteiros ) não deve exceder : * * * Para o bifenilo : 70 mg ; para o ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio , isoladamente ou em conjunto , expressos em ortofenilfenol : 12 mg * * * ii ) O tratamento deve ser indicado : * * * - no comércio por grosso , nas facturas e numa das superfícies exteriores das embalagens , pela menção : « Conservado por meio de ... » seguido do nome da ou das substâncias utilizadas * * * - no comércio a retalho , por uma indicação visível que assegure de maneira inequívoca a informação do consumidor * E 232 * Ortofenilfenato de sódio * a ) Exclusivamente para o tratamento de superfície de citrinos * * * b ) No momento da colocação no mercado dos citrinos : * * * i ) O teor residual por kg de citrinos ( frutos inteiros ) não deve exceder : * * * Para o bifenilo : 70 mg ; para o ortofenilfenol e ortofenilfenato de sódio , isoladamente ou em conjunto , expressos em ortofenilfenol : 12 mg * * * ii ) O tratamento deve ser indicado : * * * - no comércio por grosso , nas facturas e numa das superfícies exteriores das embalagens , pela menção : « Conservado por meio de ... » seguido do nome da ou das substâncias utilizadas * * * - no comércio a retalho , por uma indicação visível que assegure de maneira inequívoca a informação do consumidor * 3 . A alínea b ) do artigo 5 º é suprimida . Artigo 2 º Os Estados-membros tomarão as medidas necessárias para que a colheita das amostras e as análises para pesquisa e dosagem do bifenilo , do ortofenilfenol e do ortofenilfenato de sódio nos citrinos sejam efectuadas , no interior e exterior dos citrinos , em conformidade com as disposições dos Anexos I , II , III e IV da presente directiva . Artigo 3 º 1 . Os Estados-membros porão em vigor as medidas necessárias para darem cumprimento à presente directiva o mais tardar a partir de 1 de Julho de 1968 e desse facto informarão imediatamente a Comissão . 2 . Até 1 de Julho de 1968 , os Estados-membros podem manter as disposições das legislações nacionais relativas ao tratamento de superfície dos citrinos pelo bifenilo , o ortofenilfenol e o ortofenilfenato de sódio . Artigo 4 º Os Estados-membros são destinatários da presente directiva . Feito em Bruxelas em 27 de Junho de 1967 . Pelo Conselho O Presidente R. VAN ELSLANDE (1) JO n º 63 de 3 . 4 . 1967 , p. 990/67 . (2) JO n º 64 de 5 . 4 . 1967 , p. 1005/67 . (3) JO n º 12 de 27 . 1 . 1964 , p. 161/64 . (4) JO n º 233 de 20 . 12 . 1966 , p. 3947/66 . ANEXO I MODALIDADES DE COLHEITA DE AMOSTRAS DE CITRINOS PARA O CONTROLO DOS CONSERVANTES A . Colheita das amostras I . As colheitas são efectuadas de acordo com os métodos científicos que assegurem a obtenção de amostras representativas do lote a controlar . II . As amostras devem obedecer pelo menos , às exigências seguintes : 1 . Mercadoria embalada ( caixas , cartões e recipientes similares ) N º de recipientes no lote * Até 20 * De 21 a 500 * De 501 a 1 000 * Superior a 1 000 * N º mínimo de recipientes a colher * 1 * 2 * 3 * 4 * Massa , expressa em kg , de frutos a colher por recipiente * 2 * 2 * 2 * 2 * 2 . Mercadoria a granel Massa , expressa em kg , do lote * Até 20 * De 21 a 500 * Superior a 500 * Massa , expressa em kg , a colher * 2 * 4 * 8 * III . Entende-se por lote uma parte da mercadoria que apresente as mesmas características tais como variedade , grau de maturação , tipo de embalagem . B . Acondicionamento e transporte das amostras 1 . As amostras são introduzidas em recipientes herméticos ; 2 . Os recipientes são selados ; 3 . As amostras assim acondicionadas são conduzidas o mais rapidamente possivel aos laboratórios de controlo . ANEXO II PESQUISA DE RESÍDUOS DE BIFENILO , ORTOFENILFENOL E ORTOFENILFENATO DE SÓDIO NA CASCA DOS CITRINOS 1 . Objectivo e âmbito de aplicação O método que a seguir se descreve permite verificar a presença de resíduos de bifenilo , de ortofenilfenol ( OFF ) e de ortofenilfenato de sódio na casca dos citrinos . O seu limite de sensibilidade é , em valor absoluto , da ordem de 5 µ g para o bifenilo e de 1 µ g para o OFF e para o ortofenilfenato de sódio , o que equivale respectivamente a 5 mg de bifenilo ( 5ppm ) e 1 mg de OFF ( 1ppm ) nas cascas de 1 kg de citrinos . O tratamento dos citrinos com os produtos supracitados conduz à presença de resíduos , na sua maior parte na casca dos frutos . O doseamento destes resíduos nos frutos inteiros só se considera necessário quando a sua presença é detectada nas cascas . 2 . Princípio Procede-se a uma extracção das cascas em meio ácido pelo diclorometano . O extracto é concentrado , procedendo-se em seguida à sua análise por cromatografia em camada fina , utilizando sílica-gel . A presença de bifenilo , de ortofenilfenol ou de ortofenilfenato de sódio é detectada por fluorescência e por reacções de coloração . 3 . Reagentes Cicloexano p.a. , Diclorometano p.a. , Ácido clorídrico a 25 % ( p/v ) , Sílica-gel GF 254 Merck ou equivalente , Solução acetónica de 2,4,7 -trinitrofluorenona ( Fluka , B.D.H. ou equivalente ) a 0,5 % ( TNF ) , Solução etanólica de 2,6-dibromobenzoquinona-4- clorimida a 0,1 % ( período máximo de conservação : uma semana no frigorífico ) , Solução concentrada de amoníaco , d : 0,9 , Solução padrão de bifenilo puro a 1 % em cicloexano , Solução padrão de ortofenilfenol puro a 1 % em cicloexano . 4 . Aparelhos e utensílios Misturador , Balão de 250 ml , de boca esmerilada , com um condensador de refluxo , Evaporador de pressão reduzida , Micropipetas , Equipamento para cromatografia de camada fina incluindo placas com dimensões 20 × 20 cm , Lâmpada U.V. ( 254 nm ) : a intensidade deve ser tal que uma mancha de 5 µ g de bifenilo seja perceptível , Pulverizador para reagentes , Estufa . 5 . Técnica a ) Preparação da amostra e extracção Cortam-se em duas metades todos os frutos da amostra colhida para controlo . Uma metade de cada fruto destina-se ao doseamento dos resíduos de bifenilo e ( ou ) ortofenilfenol . Nas outras metades colhem-se fragmentos de casca para obter uma amostra com cerca de 80 g . Estes fragmentos são cortados em pedaços , moídos no misturador e introduzidos no balão de 250 ml ; adiciona-se 1 ml de ácido clorídrico a 25 % e 100 ml de diclorometano . A mistura é aquecida sob o condensador durante 10 minutos . Após arrefecimento e lavagem do condensador com cerca de 5 ml de diclorometano , filtra-se a mistura utilizando um filtro de pregas . Coloca-se a solução no evaporador e adicionam-se alguns fragmentos de pedra-pomes . A solução é concentrada a pressão reduzida , à temperatura de 60 ° C , até obtenção de um volume final de aproximadamente 10 ml . No caso de se utilizar um evaporador rotativo , o balão deve ser mantido em posição fixa , para evitar perdas de bifenilo devidas à formação de uma película do produto na parede superior do balão . b ) Cromatografia Introduzem-se num misturador 30 g de sílica-gel e 60 ml de água . Mistura-se durante um minuto ; em seguida , aplica-se a mistura sobre 5 placas cromatográficas e estende-se de modo a obter uma camada com cerca de 0,250 mm de espessura . Submetem-se as placas assim recobertas , durante 15 minutos , a uma corrente de ar quente e em seguida introduzem-se numa estufa onde são mantidas , durante 30 minutos , a 110 ° C . Após arrefecimento , cada placa é dividida em bandas de 2 cm de largura por traços paralelos que devem penetrar na camada de recobrimento até à superfície da placa . Depositam-se sobre cada banda , a cerca de 1,5 cm do bordo , 50 µl do extracto a analisar , numa série de gotas justapostas . Reserva-se pelo menos 1 banda para testemunha , onde se depositam 1 µl ( ou seja 10 µg ) das soluções-padrão de bifenilo e de ortofenilfenol . As placas cromatográficas são desenvolvidas com uma mistura de cicloexano e diclorometano ( 215 : 95 ) nas cubas previamente revestidas no interior com papel de filtro . c ) Detecção e identificação A presença de bifenilo e de ortofenilfenol detecta-se pelo aparecimento de manchas à luz U. V. ( 254 nm ) . Tendo o ortofenilfenato de sódio sido transformado em ortofenilfenol aquando da extracção em meio ácido , a sua presença não se diferencia da do ortofenilfenol . A identificação dos produtos é efectuada do seguinte modo : i ) O bifenilo forma uma mancha amarela , à luz do dia , por pulverização com a solução de TNF ; ii ) O ortofenilfenol forma uma mancha azul por pulverização com a solução de 2,6-dibromobenzoquinona-4-clorimida , seguida de uma rápida passagem numa corrente de ar quente e exposição numa atmosfera saturada de amoníaco . ANEXO III DOSEAMENTO DOS RESÍDUOS DE BIFENILO NOS CITRINOS 1 . Objectivo e âmbito de aplicação O método que a seguir se descreve permite dosear os resíduos de bifenilo nos citrinos ( frutos inteiros ) . A margem de erro dos resultados é de 10 % para teores de bifenilo superiores a 10 mg/kg de frutos ( 10 ppm ) . 2 . Princípio Após destilação em meio ácido e extracção pelo cicloexano , procede-se à separação por cromatografia em camada fina utilizando sílica-gel . Obtido o cromatograma , elui-se o bifenilo e doseia-se espectrofotometricamente a 248 nm . 3 . Reagentes Ácido sulfúrico concentrado , Emulsão antiespuma , à base de silicone , Cicloexano p.a. , Hexano p.a. , Etanol p.a. , Sulfato de sódio anidro , Sílica-gel GF 254 Merck ou equivalente , Solução padrão de bifenilo puro a 1 % , em cicloexano : diluir com cicloexano a fim de obter as três soluções seguintes : ( a ) 0,6 µg/µl ; ( b ) 1 µg/µl ; ( c ) 1,4 µg/µl . 4 . Aparelhos e utensílios Misturador de 1 l , Balão de destilação de 2 l com separador do tipo Clevenger (1) alterado e condensador de refluxo , Balão aferido de 10 ml , Micropipetas de 50 µl , Equipamento para cromatografia de camada fina ( placas de 20 × 20 cm ) , Estufa , Centrífuga com tubos cónicos de 15 ml , Espectrofotómetro U.V . 5 . Técnica a ) Preparação da amostra e extracção Cortam-se em duas metades todos os frutos da amostra colhida para controlo . Uma metade de cada fruto destina-se ao doseamento dos resíduos do bifenilo , do OFF ou do ortofenilfenato de sódio . As outras metades são moídas ou trituradas até obtenção de uma mistura homogénea . Retiram-se , pelo menos , duas subamostras de 200 mg , nas quais se efectua a análise segundo o processo abaixo indicado . Cada subamostra é introduzida num misturador com 100 ml de água e triturada a baixa velocidade durante alguns segundos . Acrescenta-se uma quantidade de água tal que o volume da mistura atinja 3/4 da capacidade do misturador . Tritura-se , em seguida , a grande velocidade durante 5 minutos . Transfere-se o homogeneizado assim obtido para um balão de destilação de 2 l . Lava-se o misturador com água e juntam-se as águas de lavagem ao conteúdo do balão . ( A quantidade total de água a utilizar para a trituração e lavagens é de 1 l ) . Adicionam-se à mistura 2 ml de ácido sulfúrico , 1 ml de emulsão antiespuma e uma porção de pedra-pomes . Montam-se no balão o separador e o condensador . Introduz-se no separador água destilada até que o nível de água ultrapasse nitidamente a ramificação inferior do tubo lateral de retorno , e em seguida adicionam-se 7 ml de cicloexano . Destila-se durante cerca de 2 horas . Recolhe-se em seguida o conteúdo do separador no balão aferido de 10 ml , lava-se o separador com cerca de 1,5 ml de cicloexano , adiciona-se a solução de lavagem ao conteúdo do balão e completa-se o volume com cicloexano . Introduz-se , para terminar , um pouco de sulfato de sódio anidro e agita-se . b ) Cromatografia Introduzem-se num misturador 30 g de sílica-gel e 60 ml de água . Mistura-se durante 1 minuto ; em seguida , aplica-se a mistura sobre 5 placas cromatográficas e estende-se de modo a obter uma camada de cerca de 0,250 mm de espessura . Submetem-se as placas assim recobertas , durante 15 minutos , a uma corrente de ar quente e em seguida introduzem-se numa estufa onde são mantidas , durante 30 minutos , a 110 ° C . Após arrefecimento , cada placa é dividida em 4 bandas de 4,5 cm de largura por traços paralelos que devem penetrar na camada de recobrimento até à superficie da placa . Depositam-se sobre uma das bandas , a cerca de 1,5 cm do bordo da placa , 50 µl do extracto a analisar , numa série de gotas justapostas . Sobre cada uma das três bandas restantes depositam-se 50 µl das soluções-padrão ( a ) , ( b ) e ( c ) , respectivamente correspondentes a doses de bifenilo de 30 , 50 e 70 µg . Se se efectuarem análises em série , pode prescindir-se de depositar as soluções-padrão em todas as placas e estabelecer-se a curva de referência a partir da média dos valores obtidos , em pelo menos 5 placas , com as mesmas doses-padrão . c ) Desenvolvimento dos cromatogramas e eluição Os cromatogramas são desenvolvidos numa altura de 17 cm nas cubas previamente revestidas no interior com papel de filtro . As placas são secas ao ar livre . As zonas nas quais está localizado o bifenilo são detectadas à luz U.V. a 254 nm , e delimitadas por rectângulos de iguais superfícies . As superfícies assim delimitadas são imediatamente raspadas , em toda a espessura da camada de suporte . O bifenilo é extraído com 10 ml de etanol , durante 10 minutos , agitando várias vezes . Transfere-se para os tubos de centrifugação e centrifuga-se , durante 5 minutos , a 2 500 rotações por minuto . Colhe-se do mesmo modo uma zona testemunha com a mesma dimensão . No caso de análises em série , colhe-se esta zona numa banda virgem da placa ; no caso de análises individuais , colhe-se numa banda ocupada por um padrão sob a zora que contém o bifenilo . d ) Determinação espectrofotométrica Decanta-se o líquido sobrenadante para as células do espectrofotómetro e determina-se a extinção a 248 nm , por comparação com um extracto testemunha proveniente de uma zona cromatográfica isenta de bifenilo . 6 . Cálculo dos resultados Traça-se uma curva de referência tomando respectivamente como coordenadas as doses de difenilo de 30 , 50 e 70 µg e os valores de extinção correspondentes , determinados no espectrofotómetro . A curva assim obtida é uma linha recta que passa pela origem . Este gráfico permite a leitura directa em ppm dos teores de bifenilo das amostras , a partir dos valores de extinção dos seus extractos . (1) Ver figura na página 9 . ANEXO IV DOSEAMENTO DOS RESIDUOS DE ORTOFENILFENOL E ORTOFENILFENATO DE SODIO NOS CITRINOS 1 . Objectivo e âmbito de aplicação O método que a seguir se descreve permite dosear os resíduos de ortofenilfenol ( OFF ) e de ortofenilfenato de sódio nos citrinos ( frutos inteiros ) . Os resultados apresentam um erro por defeito cujo valor médiose situa entre 10 e 20 % para um teor de OFF ou ortofenilfenato de sódio na ordem de 12 ppm . 2 . Princípio Após destilação e meio ácido e extracção pelo éter diisopentílico , o extracto é purificado e tratado por uma solução de 1-fenil-2,3-demetil-4-aminopirazolona ( 5 ) ( = 4-aminoantipirina ) . Desenvolve-se uma coloração vermelha cuja intensidade é medida pelo espectrofotómetro a 510 nm . 3 . Reagentes Ácido fosfórico a 70 % , Emulsão antiespuma , à base de silicone , Éter diisopentílico p.a. , Cicloexano purificado : agitar 3 vezes uma solução de hidróxido de sódio a 4 % , lavar 3 vezes com água destilada , Solução de hidróxido de sódio a 4 % , Solução tampão de pH 10,4 : introduzir num balão aferido de 2 l : 6,64 g de ácido bórico , 8,00 g de cloreto de potássio e 93,1 ml de solução de hidróxido de sódio 1 N ; misturar e perfazer o volume com água destilada . Reagente I : dissolver 1,0 g de 1-fenil-2,3- dimetil-4-aminopirazolona ( 5 ) ( = 4-aminoantipirina ) em 100 ml de água destilada , Reagente II : dissolver 2,0 g de ferrocianeto de potássio em 100 ml de água destilada . Os reagentes I e II devem ser conservados em frascos de vidro escuro e são estáveis apenas durante 14 dias , Sílica-gel , Solução padrão : dissolvem-se 10 mg de OFF puro em 1 ml de NaOH 0,1 N ; perfazer a 100 ml com uma solução de borato de sódio 0,2 ( 1 ml = 100 µg ) . Para a obtenção da curva de referência dilui-se a 1 : 10 com a solução tampão . 4 . Aparelhos e utensílios Moinho de picar ou triturador , Misturador , Balão de destilação de 1 l com separador do tipo Clevenger (1) alterado e condensador de refluxo , Banho de infra-vermelhos , Ampola de decantação de 200 ml , Provetas graduadas de 25 e 100 ml , Balões aferidos de 25 e 100 ml , Pipetas de 1 a 10 ml , Pipetas aferidas de 0,5 ml , Espectrofotómero com células de 5 cm . 5 . Técnica Cortam-se em duas metades todos os frutos da amostra colhida para controlo . Uma metade de cada fruto destina-se ao doseamento dos resíduos de bifenilo , de OFF ou de ortofenilfenato de sódio . As outras metades são moídas ou trituradas até obtenção de uma mistura homogénea . Retiram-se , pelo menos , duas subamostras de 250 g , nas quais se efectua a análise segundo o processo abaixo indicado . Cada subamostra é introduzida num misturador com 500 ml de água e triturada até obtenção de uma massa homogénea , impalpável e na qual as células oleosas não sejam perceptíveis . Retiram-se , segundo o teor presumível em OFF , 150 a 300 g do homogeneizado e introduzem-se no balão de destilação de 1 l com uma quantidade de água que leve o conteúdo do balão a 500 g . Após adição de 10 ml de ácido fosfórico a 70 % , uma porção de pedra-pomes e 0,5 ml de emulsão antiespuma , adapta-se o separador e o condensador ao balão . Introduzem-se no separador 10 ml de éter diisopentílico e aquece-se lentamente o balão num banho de infra-vermelhos , evitando o cozimento do homogeneizado e a formação de espuma . Destila-se durante cerca de 6 horas . Transfere-se o conteúdo do separador para uma ampola de decantação de 200 ml , lava-se o separador e o condensador com 60 ml de cicloexano e , em seguida , com 60 ml de água . Adicionam-se os líquidos de lavagem ao conteúdo da ampola a decantar . Agita-se vigorosamente e , após separação das fases , decanta-se e elimina-se a fase aquosa . Para extrair o OFF , a fase orgânica é agitada vigorosamente 5 vezes , cada vez durante 3 minutos , com 10 ml de hidróxido de sódio a 4 % . As soluções alcalinas são reunidas , neutralizadas até pH 9-10 com ácido fosfórico em presença de papel com fenolftaleína e completadas a 100 ml com água destilada . Adiciona-se um pouco de sílica-gel , a fim de clarificar a solução que apresenta uma ligeira turvação , agita-se e filtra-se , em seguida , com um filtro seco de porosidade fina . Tendo em atenção que o máximo de precisão e de exactidão no desenvolvimento da coloração se atinge na presença de quantidades de OFF compreendidas entre 10 e 70 µg , retira-se com uma pipeta uma alíquota de 0,5 a 10 ml de solução , conforme as quantidades de OFF previsíveis . Introduz-se a toma num balão aferido de 25 ml ; adiciona-se 0,5 ml do reagente I , 10 ml da solução tampão e , em seguida , 0,5 ml do reagente II . Perfaz-se o volume com a solução tampão e agita-se energicamente . Após 5 minutos , mede-se no espectrofotómetro a extinção da coloração vermelha a 510 nm , por comparação com uma testemunha isenta de extracto . A intensidade da coloração não se altera durante 30 minutos . O cálculo efectua-se em função dos valores da curva de referência traçada nas memas condições com a solução padrão de OFF . 6 . Observações Para cada análise , é recomendado fazer uma dupla determinação espectrofotométrica com volumes diferentes do extracto alcalino neutralizado . Os citrinos não tratados dão , segundo este método , valores em branco que podem atingir 0,5 ppm para as laranjas e 0,8 ppm para os limões . CLEVENGER ( Ponto 4 do Anexo III ; Ponto 4 do Anexo IV ) : v. JO (1) Ver figura na página 9 .